ORF1編碼的四種非結(jié)構(gòu)蛋白可用于戊型肝炎病毒的基因分型

胡玲玲，王躍榮，鄭海音

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，上海 200071）

0 引言

戊型肝炎病毒（hepatitus E virus，HEV）是病毒性戊型肝炎的病原體，以感染青壯年為主，在中國內(nèi)陸、墨西哥和東南亞地區(qū)等均發(fā)生過暴發(fā)流行，近年來，在發(fā)達(dá)國家戊型肝炎的流行增多[1]。孕婦患病率較高，且病情嚴(yán)重，容易導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎等[2]。

HEV基因組全長約7.5kb，包括5ˊ非編碼區(qū)、3ˊ非編碼區(qū)和3個開放閱讀框（Openreadingframe,ORF）[3]。ORF1基因長度約為5082bp，編碼五種非結(jié)構(gòu)蛋白：甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase)、多聚脯氨酸鉸鏈(poly-prolinehinge)、 解 旋 酶 (helicase)、木瓜樣半胱氨酸蛋白酶(papain-like protease)和RNA依賴的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase)。ORF1不僅與病毒的復(fù)制有關(guān)，而且還在病毒的培養(yǎng)、病毒適應(yīng)及致病性等發(fā)揮作用。

HEV的不同基因型在致病性方面存在差異，感染后的臨床癥狀和病程結(jié)局也有所不同。核酸序列分析表明，目前能感染人類的HEV有4個基因型，分型的依據(jù)是全基因序列的核苷酸同源性，因此結(jié)果最為準(zhǔn)確。但全基因測序歷時長耗費(fèi)大，序列比對也比較困難，我們之前的研究[4]發(fā)現(xiàn)ORF1編碼的甲基轉(zhuǎn)移酶可作為HEV的分型依據(jù)，甲基轉(zhuǎn)移酶是HEV的ORF1所編碼的五個非結(jié)構(gòu)蛋白之一，本研究選取ORF1編碼的其他的四個非結(jié)構(gòu)蛋白來探討其是否可以用于HEV的基因分型，報道如下。

1 材料與方法

1.1 HEV參考株

Chi-XJ1株（NC_001434）為基因型4型，是GenBank中測序最全且比較準(zhǔn)確的?；?型只有墨西哥分離株(MEX-14)的全基因序列收錄在GenBank中，在此沒有列入研究，主要對基因1、3和4型進(jìn)行探討。

1.2 多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析

從 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov） 的GenBank中獲取了35株HEV病毒株，其基因組是測序完整的且能感染人類，包括12個1型病毒株，9個3型病毒株，14個4型病毒株。我們將這35株HEV全序列以及編碼蛋白質(zhì)的基因片段采用Clustal W程序進(jìn)行多序列比對，用treev32繪制基因進(jìn)化樹，研究其進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)測HEV的蛋白表達(dá)圖譜

在GenBank中僅可以下載到Chi-XJ1株(NC_001434)的主要蛋白質(zhì)木瓜樣半胱氨酸蛋白酶、多聚脯氨酸鉸鏈、解旋酶和RNA依賴的RNA聚合酶的編碼序列，我們用Clustal W將Chi-XJ1株編碼這四種蛋白質(zhì)的完整的編碼序列與其他各株HEV基因組進(jìn)行了比對，預(yù)測出其他GenBank中沒有給出的各株HEV的四種主要蛋白編碼區(qū)。

2.2 ORF1編碼的四種非結(jié)構(gòu)蛋白的基因序列可用于HEV的基因分型

將通過以上方法所得到的四種非結(jié)構(gòu)蛋白的基因序列用Clustal W進(jìn)行比對，并用treev32進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)編碼木瓜樣半胱氨酸蛋白酶、多聚脯氨酸鉸鏈、解旋酶和RNA依賴的RNA聚合酶這四種非結(jié)構(gòu)蛋白的多序列比對均將這35株HEV正確的分成了3個基因型，且每株病毒都被正確的歸類到了自己的基因型中，與GenBank中的報道是一致的。所以我們有理由可以把木瓜樣半胱氨酸蛋白酶、多聚脯氨酸鉸鏈、解旋酶和RNA依賴的RNA聚合酶這四種非結(jié)構(gòu)蛋白作為HEV的分型依據(jù)，結(jié)果見圖1-圖4。

圖1 35株HEV木瓜樣半胱氨酸蛋白酶基因序列的進(jìn)化樹分析

圖2 35株HEV多聚脯氨酸鉸鏈基因序列的進(jìn)化樹分析

圖3 35株HEV解旋酶基因序列的進(jìn)化樹分析

圖4 35株HEV的RNA依賴的RNA聚合酶基因序列的進(jìn)化樹分析

3 討論

戊型病毒性肝炎是由HEV引起的肝臟病變，既可以引起臨床散發(fā)病例，也可以導(dǎo)致大規(guī)模的暴發(fā)流行。雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)特異性針對戊型肝炎的治療藥物，但臨床上需根據(jù)戊肝患者的臨床類型、病情輕重及并發(fā)癥區(qū)別對待。

HEV感染的患者病毒RNA可較早的在糞便或血清中發(fā)現(xiàn)，但兩到四周后血清中才出現(xiàn)特異性IgM抗體，而特異性的IgG抗體出現(xiàn)較晚且長期持續(xù)存在，其中IgM抗體可作為HEV急性感染的標(biāo)志。戊型肝炎的實驗室診斷主要包括RT-PCR檢測血清中HEV核酸，免疫電鏡法檢測糞便中HEV病毒顆粒，酶聯(lián)免疫檢測法檢測血清中抗HEV IgM和IgG抗體。核酸檢測是戊型肝炎診斷的金標(biāo)準(zhǔn)；電鏡法對儀器設(shè)備以及人員要求較高，應(yīng)用受到限制；酶聯(lián)免疫檢測法可以對HEV定性檢測，成本較低，且靈敏度和特異度也較高，目前應(yīng)用較為廣泛，但是不同檢測試劑的檢測結(jié)果時常有出現(xiàn)不一致的情況[1]，原因可能是重組抗原不能正確折疊，或HEV不同的基因型在非免疫優(yōu)勢表位間存在差異。

一般認(rèn)為HEV感染是急性自限性疾病，但2008年Kamar等[5]首先發(fā)現(xiàn)8例器官移植的患者發(fā)生了HEV慢性持續(xù)性感染，檢測其基因型為3型，另一項回顧性研究發(fā)現(xiàn)感染了HEV的患者進(jìn)行器官移植60%以上進(jìn)展成了慢性戊型肝炎[6]。

戊肝患者發(fā)病的嚴(yán)重性及預(yù)后與HEV的基因類型密切相關(guān)[7-9]，研究發(fā)現(xiàn)我國新疆、尼泊爾等地區(qū)孕婦感染1型HEV后病死率高達(dá)20%。有些伴有其他肝病的患者若同時感染4型HEV后，可引起迅速的肝纖維化、肝硬化或急性肝衰竭等癥狀。目前人體內(nèi)檢測出的HEV有4種基因型[10]，基因1型和2型引起的HEV感染主要引起戊肝的爆發(fā)流行，且多是急性自限性?；?型和4型HEV為人畜共患病原體，主要引起散發(fā)病例，近些年的發(fā)病呈上升趨勢。因此對于高流行地區(qū)的一些特殊人群采取有效的預(yù)防措施是必要的[11]。HEV的研究日漸深入，疫苗的研制也日趨成熟[12-13]，有望降低戊肝的發(fā)病率和死亡率。

隨著基因測序技術(shù)的快速發(fā)展，HEV分型是進(jìn)行全基因或部分基因的測序，但全基因序列較長，可以嘗試選取較短的基因序列替代全基因組序列進(jìn)行比對。ORF1可以編碼五種與病毒復(fù)制相關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白，其基因編碼序列都比全基因組序列短，且我們之前研究[4]已發(fā)現(xiàn)甲基轉(zhuǎn)移酶的基因序列可以代替全基因序列對HEV進(jìn)行分型，如果其他四個ORF1編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白其編碼序列可以發(fā)揮同樣的作用，那么可以為HEV的分型提供更多、更簡便快捷的方法。

我們從GenBank中獲取了35株HEV病毒株，其基因組是測序完整的且能感染人類，包括12個1型病毒株，9個3型病毒株，14個4型病毒株。Chi-XJ1株（NC_001434）是GenBank中信息最全且比較準(zhǔn)確的，以它為參照，明確的預(yù)測出ORF1編碼的四種非結(jié)構(gòu)蛋白的基因序列，將這35株HEV的木瓜樣半胱氨酸蛋白酶、解旋酶、多聚脯氨酸鉸鏈和RNA依賴的RNA聚合酶基因序列分別用Clustal W進(jìn)行多序列比對，并用treev32繪制進(jìn)化樹，描述各病毒株之間的親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與GenBank中的報道是一致的，皆可以分為1型、3型和4型，與我們之前的研究[4]中HEV全基因組的多序列比對的進(jìn)化樹結(jié)果一致，雖然各型內(nèi)的進(jìn)化關(guān)系稍有不同。但與HEV基因組全長相比，我們選取的片段具有更大的優(yōu)勢，其中RNA依賴的RNA聚合酶只有1460bp；其他的基因序列則更短，木瓜樣半胱氨酸蛋白酶為479bp、解旋酶為734bp，多聚脯氨酸鉸鏈只有200bp。

綜上所述，通過本研究發(fā)現(xiàn)，只需設(shè)計合適的引物擴(kuò)增出ORF1編碼的四種非結(jié)構(gòu)蛋白木瓜樣半胱氨酸蛋白酶、RNA依賴的RNA聚合酶、解旋酶和多聚脯氨酸鉸鏈其中一個的基因序列，再將PCR產(chǎn)物測序并做進(jìn)化樹分析即可簡便、快速的對HEV進(jìn)行基因分型。