鐵皮石斛自交和雜交親和性的細(xì)胞學(xué)研究

高 楊，林韌安，袁超群，馬麗婭，王佳囡，朱玉球，高燕會

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300；2.浙江省樂清市林業(yè)良種科技中心，浙江 樂清 325600）

鐵皮石斛Dendrobium officinale又名黑節(jié)草，屬蘭科Orchidaceae石斛屬Dendrobium多年生附生草本植物，主要分布于中國安徽、浙江、福建、云南、四川等省和華南某些地區(qū)，具有抗腫瘤、抗衰老、增強機體免疫力、降血糖和有效減輕肝損傷等作用［1－3］，被譽為 “中華九大仙草”之首，國際藥用植物界的 “藥界大熊貓”［3］。對鐵皮石斛種質(zhì)資源的保存研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛自交結(jié)實率較低，甚至不結(jié)實，其優(yōu)良品種只能通過種內(nèi)雜交或者無性繁殖才能保存。因此，深入研究鐵皮石斛自花不育機制，廣泛開展種內(nèi)種間雜交育種是實現(xiàn)鐵皮石斛種質(zhì)保存以及種質(zhì)資源創(chuàng)新的有效手段。近年來，有關(guān)鐵皮石斛花粉活力［4］、 雜交育種［5］、 栽培技術(shù)［6］及化學(xué)成分［7］等的研究較多， 但涉及鐵皮石斛自交和雜交親和性細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)和機制方面的研究甚少。與眾多顯花植物一樣，鐵皮石斛在長期進(jìn)化過程中形成了自交不親和的生殖隔離機制，表現(xiàn)為雌雄蕊發(fā)育正常且同熟，自花或同基因型異花傳粉后卻不能結(jié)實［8］。對顯花植物自交不親和性的研究一直是植物界的研究熱點之一，十字花科Cruciferae［9-10］，罌粟科Papaveraceae［11］，紫葳科Bignoniaceae［12］，薔薇科Rosaceae［13］等植物的自交不親和性的細(xì)胞學(xué)和分子遺傳學(xué)研究已較為深入。石斛屬植物自交不親和性的研究雖已有報道［14-15］，但關(guān)于鐵皮石斛自交不親和性尚不確定。為了進(jìn)一步了解鐵皮石斛自交和雜交親和性生物學(xué)機制，本研究對自交（自花授粉）和種內(nèi)雜交的樣品進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察，考察自交和雜交后花粉管的生長情況，為鐵皮石斛的自交不結(jié)實現(xiàn)象的類型和機制研究、種質(zhì)資源保育、雜交育種及新品種選育提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用 8 個 鐵皮石斛 親 本 材 料 分 別 為 78×69， 17×163， 124×30， 18×22， 13×163， 966，C13，6A2B。栽培于天目山鐵皮石斛示范種植基地，為設(shè)施栽培，栽培基質(zhì)為松樹皮。各材料隨機選擇生長健壯并正常開花的200朵花分別進(jìn)行自交（自花授粉）和種內(nèi)雜交（正交和反交），重復(fù)3次。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉生活力測定 于2016年5-6月盛花期采集8種鐵皮石斛的新鮮花粉，采用聯(lián)苯胺法［16-17］測定親本的花粉生命力。觀察5視野·材料-1，觀察花粉數(shù)量≥30個·視野-1，重復(fù)3次?；ǚ勖劝l(fā)率=萌發(fā)花粉數(shù)/觀察花粉數(shù)×100%。

1.2.2 自交和種內(nèi)雜交 選擇莖稈粗壯且分節(jié)明顯、無病蟲害的鐵皮石斛植株作為親本，于開花的第3～5天，選擇200朵·親本-1，進(jìn)行自交和雜交試驗。自交花粉來自同株自花或異花成熟花粉，雜交時去掉母本雄蕊，夾掉唇瓣，去除藥帽，用鑷子將花粉團(tuán)送入母本柱頭內(nèi)進(jìn)行授粉［18］。授粉后注明親本和授粉時間，用于花粉管熒光顯微觀察和坐果率的統(tǒng)計。

1.2.3 花粉管萌發(fā)觀察及生長測定 分別于授粉后1，2，4，8，12，24，48，72和96 h，采集雌蕊，15 朵·樣品-1， 甲醛-冰乙酸-乙醇（FAA）固定液［V（70%乙醇）∶V（冰乙酸）∶V（甲醛）=90∶5∶5］固定， 4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?9-20］。采用脫色苯胺藍(lán)熒光染色技術(shù)［11］測定花粉管萌發(fā)及生長情況。在常溫下，用8 mol·L-1氫氧化鈉（NaOH）溶液軟化脫色2 h，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的苯胺藍(lán)溶液染色6 h，再用甘油壓片；分別在萊佧顯微鏡（Leica DM 4000，德國）明視場和熒光模式紫外光激發(fā)狀態(tài)下觀察和拍照。樣品經(jīng)FAA固定、氫氧化鈉處理及蒸餾水清洗等過程，簡單附著在柱頭的花粉將會被洗掉，因此最終留在柱頭上的花粉可視為萌發(fā)?；ǚ酃軣晒庥^察時分別采用未授粉染色和未染色的雌蕊為對照，比較花粉管萌發(fā)和花粉管生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 花的結(jié)構(gòu)

鐵皮石斛花為總狀花序、唇型花。花瓣與萼片均為乳黃綠色，其中1枚花瓣變異為唇瓣；雌蕊與雄蕊合為一體形成典型的合蕊柱，雌蕊位于下方，雄蕊在上方，中間有隔膜將兩者隔開；隔膜下方有1個柱頭窩，上方為藥室，藥室有1個藥帽覆蓋［20］；花粉粒呈乳黃色水滴狀，4粒，兩兩連在一起形成2個花粉塊?；ńY(jié)構(gòu)如圖1所示。

2.2 親本花粉生活力測定

采用聯(lián)苯胺法［17］測定花粉生命力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：8個親本的花粉生活力均高于88.0%（圖2），說明試驗材料的花粉活性均較高，符合后續(xù)研究需要。

2.3 花粉管的萌發(fā)和生長

圖1 鐵皮石斛花的結(jié)構(gòu)Figure 1 Flower structure of Dendrobium officinale

鐵皮石斛花粉授到柱頭上后，隨即開始水合并萌發(fā)，長出花粉管?；ǚ酃芡ㄟ^乳突細(xì)胞間隙和乳突細(xì)胞進(jìn)入柱頭，進(jìn)而匯集到花柱道中，經(jīng)花柱道內(nèi)表皮腺細(xì)胞分泌的黏液層向下生長［14］。對柱頭染色處理可見：花粉管在熒光的激發(fā)下呈現(xiàn)藍(lán)綠色熒光，可以觀察到花粉粒在柱頭上的萌發(fā)和花粉管的生長情況。顯微觀察發(fā)現(xiàn)：鐵皮石斛花柱道中空，花柱從上到下呈現(xiàn)出花柱道逐漸貼合的趨勢；自交和雜交花粉管都匯集在一起沿著兩壁縱向生長（圖 3A）。

自花授粉交與雜交授粉對花粉粒在柱頭的萌發(fā)情況無明顯差異。授粉1 h內(nèi)，花粉管生長速度極快。1 h后伸長變緩，此時花粉管生長到花柱基部并接近子房，花粉管中均能觀察到精核細(xì)胞，但是雜交處理的精核數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過自交（圖3B，圖3C）。由于花粉管匯集在一起且縱向生長，從形態(tài)上看自交與雜交處理未見明顯差異（圖3D，圖3E）。授粉后約2 h，花粉管生長到達(dá)花柱基部，此時發(fā)現(xiàn)雜交后的花粉管繼續(xù)向子房生長，而自交后的花粉管在花柱基部生長減緩，部分生長停滯（圖3F），只有少數(shù)能夠進(jìn)入子房。不同的鐵皮石斛親本花粉管的生長速度也略有不同。

圖2 不同鐵皮石斛親本花粉萌發(fā)率Figure 2 Determination of pollen viability of differentDendrobium officinale cultivars

圖3 鐵皮石斛自交和雜交后花粉管在花柱中的生長情況Figure 3 Growth of pollen tube in the style of self pollination and hybridization of Dendrobium officinale

2.4 花粉管在子房中的生長特性

花粉管伸長進(jìn)入子房后，在側(cè)膜胎座內(nèi)繼續(xù)生長。觀察發(fā)現(xiàn)，自交授粉后的2～4 h，花粉管生長緩慢，只有少數(shù)進(jìn)入子房內(nèi)部（圖4A）；雜交授粉4 h后，大量花粉管呈束狀進(jìn)入子房，沿胎座空隙向子房底部生長（圖4B）。由此認(rèn)為，自交與雜交處理盡管在花粉管進(jìn)入子房的時間上差異不顯著，但數(shù)量明顯少于雜交。此后1 d內(nèi)，自交處理多數(shù)花粉管停留在花柱基部與子房連接的上下區(qū)域緩慢生長，即便有少數(shù)能夠進(jìn)入子房，長到一定長度后最終也停止生長，未能達(dá)到子房底部（圖4C）；雜交處理花粉管在繼續(xù)沿子房緩慢向下生長（圖4D），并在授粉后48 h生長至子房1/3處（圖4E），直至授粉96 h，子房內(nèi)依舊有大量的花粉管，子房表現(xiàn)為飽滿（圖4F）；而自交處理的花粉管數(shù)量在48 h后明顯減少，子房的飽滿度較低（圖4G），授粉后96 h，花柱內(nèi)的花粉管基本都消失，子房也出現(xiàn)嚴(yán)重的萎縮現(xiàn)象（圖4H）。由此推測，鐵皮石斛自交不能結(jié)實可能是由于某種自身的機制導(dǎo)致精核無法到達(dá)胚珠完成受精而造成。

圖4 鐵皮石斛自交和雜交花粉管在子房中的生長Figure 4 Growth of pollen tube of self pollination and hybridization in Dendrobium officinale

2.5 自交和雜交結(jié)實情況

于2016年6月和10月分別對鐵皮石斛自交和雜交坐果率進(jìn)行統(tǒng)計（表1）。相同條件下，鐵皮石斛親本自交的坐果率均為0，而種內(nèi)雜交坐果率普遍為60.0%～96.0%，大部分正交和反交的坐果率相差不大，僅有6A2B和18×22作為親本時正反交坐果率差異較大，分別為94.8%和29.5%，這可能與親本之間的親和力有關(guān)。

表1 鐵皮石斛種內(nèi)雜交坐果率Table 1 Percentage of fertile fruit of Dendrobium officinale interspecific hybridization

3 討論

受到花粉與柱頭、花粉管與花柱及雌雄配子體之間識別作用的限制，植物自交和雜交親和性障礙主要發(fā)生在花粉粒的萌發(fā)，花粉管進(jìn)入柱頭，花粉管通過花柱和受精、胚發(fā)育等階段，每個階段的障礙均可能引起自交和雜交的不親和［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，種內(nèi)雜交坐果率普遍為60.0%～96.0%，少數(shù)親本種間雜交坐果率為29.0%～34.0%，8個品種自交坐果率均為0，說明鐵皮石斛花朵種內(nèi)雜交能良好進(jìn)行，但其自交無法產(chǎn)生后代，可以認(rèn)為鐵皮石斛具有自交不親和的特性。

自交不親和是在受精過程中發(fā)生的主動識別和拒絕自交花粉的機制，根據(jù)植物花型的不同，自交不親和性可分為同形性自交不親和（homomorphic SI）和異形性自交不親和（heteromophic SI）［22］；根據(jù)花粉自交不親和性的遺傳控制方式，同形性自交不親和性又可分為孢子體型自交不親和（sporophytic SI,SSI）和配子體自交不親和（gametophytic SI,GSI）2種類型。配子體型自交不親和性即花粉在柱頭上萌發(fā)后可侵入柱頭，并能在花柱組織中延伸一段，此后受到抑制。孢子體型自交不親和性即花粉落在柱頭上不能正常萌發(fā)，或萌發(fā)后纏繞在柱頭乳突細(xì)胞上但卻無法侵入柱頭，花粉的這種行為取決于二倍體親本的基因型［11，23］。本研究在對鐵皮石斛進(jìn)行自交和雜交時，發(fā)現(xiàn)花粉管中均含有精核，花粉管具有活力能正常生長進(jìn)入花柱；授粉后1 h內(nèi)，與自交相比，雜交花粉管生長速度略快；自交后花粉管在進(jìn)入子房1/3處停止生長，而雜交花粉管順利進(jìn)入子房；48～72 h時，自交花粉管逐漸消失，雜交后的花粉管不消失。由此可以判斷，鐵皮石斛屬于配子體自交不親和性，與蘭科植物甲蟲蘭屬Restrepia［23］，石斛屬的束花石斛Dendrobium chrysanthum［18］的自交不親和性相一致。這一結(jié)果可為鐵皮石斛克服自交不親和性以及組合雜交育種、創(chuàng)制新種質(zhì)及種質(zhì)資源保育提供理論基礎(chǔ)。

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