高表達(dá)水通道蛋白7的脂肪細(xì)胞的脂代謝的研究

白曉蘇 黎智森

[摘要] 目的 研究高表達(dá)AQP7的 3T3-L1 脂肪細(xì)胞的脂代謝變化。 方法 構(gòu)建高表達(dá)的AQP7的 3T3-L1 脂肪細(xì)胞，測定AQP7mRNA和AQP7蛋白表達(dá)的變化，以及脂代謝指標(biāo)甘油和脂肪酸的變化。 結(jié)果 與對照組比較AQP7mRNA和AQP7蛋白表達(dá)明顯增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），培養(yǎng)基中甘油的水平也升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），脂肪酸的水平無變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 高表達(dá)的AQP7蛋白，可顯著減少脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油，減少脂肪細(xì)胞體積，減輕胰島素抵抗。

[關(guān)鍵詞] 脂肪細(xì)胞；水通道蛋白7；甘油

[中圖分類號] R58 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1672-4062（2018）01（b）-0025-02

隨著生活環(huán)境的改變，2 型糖尿病的（T2DM）的發(fā)生逐漸增加，T2DM是心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。肥胖與T2DM的發(fā)生密不可分，胰島素抵抗是二者的共同土壤，脂肪細(xì)胞的體積肥大和脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加是引起體內(nèi)脂肪蓄積及代謝異常的重要誘因[1-2]。脂肪細(xì)胞內(nèi)的與甘油轉(zhuǎn)運(yùn)的的水通道蛋白7（AQP7）表達(dá)的下降，與肥胖、胰島素抵抗和2型糖尿病的形成有關(guān)。該文將探討高表達(dá)AQP7的3T3-L1 脂肪細(xì)胞的脂代謝的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

pMD18T載體；Lipofectamine 2000及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)染試劑盒；3T3脂肪細(xì)胞。PCR儀，熒光定量儀。RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa 公司；抗AQP7 抗體購自艾博抗貿(mào)易有限公司，甘油含量酶法測定試劑盒購自普利萊基因有限公司； 游離脂肪酸測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，其余試劑為市售分析純。

1.2 方法

高表達(dá)APQ7的3T3脂肪細(xì)胞的建立對合成ap2的-63bp/5.4-4.9kb的啟動(dòng)調(diào)節(jié)區(qū)和AQP7基因的CDS區(qū)全序列進(jìn)行分析，構(gòu)建載體 ap2-AQP7。 構(gòu)建的腺病毒表達(dá)載體ap2-AQP7經(jīng)Pac I消化后Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，包裝病毒，收集病毒原液，并采用免疫法檢測腺病毒滴度，以不含ap2-AQP7的空載腺病毒作為陰性對照。轉(zhuǎn)染載體ap2-AQP7的3T3-L1 脂肪細(xì)胞培養(yǎng)至生長狀態(tài)良好后，進(jìn)行誘導(dǎo)分化。病毒感染3T3脂肪細(xì)胞后48 h收集細(xì)胞，行RT-Q-PCR檢測，估算目的基因含量，建立高表達(dá)的APQ7的3T3脂肪細(xì)胞模型。

測定脂肪細(xì)胞的AQP7的蛋白水平以及甘油、FFA 的含量的測定用試劑盒檢測AQP7的蛋白水平，以及測定培養(yǎng)基的甘油、游離脂肪酸的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用 SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示行t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3T3脂肪細(xì)胞的AQP7mRNA以及蛋白的表達(dá)的變化與對照組比較

試驗(yàn)組的AQP7mRNA和AQP7蛋白的表達(dá)明顯高于對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖1。

2.2 培養(yǎng)基的甘油、脂肪酸的測定

測定培養(yǎng)基上清的甘油含量，發(fā)現(xiàn)甘油含量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05 ）。脂肪酸的含量無變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05 ）。見圖1。

3 討論

糖脂代謝的異常形成和加重了糖尿病胰島素抵抗。葡萄糖進(jìn)入脂肪組織可以轉(zhuǎn)化為甘油三酯，而脂肪組織可釋放游離脂肪酸參加氧化供能。因此，游離脂肪酸、甘油三酯、葡萄糖構(gòu)成極其復(fù)雜的能量代謝網(wǎng)絡(luò)，這一網(wǎng)絡(luò)的某些環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題將導(dǎo)致肥胖、胰島素抵抗、糖尿病、血脂紊亂、動(dòng)脈粥樣硬化、泡沫細(xì)胞形成等病理變化[3]。迄今為止，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)13種水通道蛋白亞型[4]。脂肪組織只表達(dá)AQP7，尤其是在內(nèi)臟脂肪組織[5]。該課題組[6]利用只在成熟脂肪細(xì)胞表達(dá)的aP2基因，將其與AQP 7cDNA連接，轉(zhuǎn)入在脂肪組織內(nèi)并特異性高表達(dá)，與對照組比較，試驗(yàn)組的AQP7mRNA和AQP7蛋白的表達(dá)明顯增加。高表達(dá)AQP7的3T3脂肪細(xì)胞株的培養(yǎng)基中，甘油含量明顯高于對照組，亦進(jìn)一步證明，AQP7蛋白的表達(dá)增加可促進(jìn)甘油向脂肪細(xì)胞外進(jìn)行排泄，為肥大的脂肪細(xì)胞減負(fù)[7]。在該實(shí)驗(yàn)中，脂肪酸的含量無變化。MaedaN 等[8]對AQP7缺陷小鼠血漿中的甘油測定發(fā)現(xiàn)，其濃度明顯降低，但游離脂肪酸的濃度無顯著變化，這說明脂肪細(xì)胞膜上的AQP7只選擇性介導(dǎo)了甘油從細(xì)胞中的釋放而不運(yùn)輸脂肪酸。這將利于維持組織液和血漿中中的游離脂肪酸穩(wěn)定，不僅限制了脂肪酸的再次酯化，而且也防止了高游離脂肪酸水平抑制葡萄糖氧化，加重胰島素抵抗[9]，加重肥胖。

綜上所述，構(gòu)建的含有ap2-AQP7的脂肪細(xì)胞可高表達(dá)的AQP7mRNA和AQP7蛋白，脂肪細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的AQP7可顯著減少了脂肪細(xì)胞內(nèi)的甘油含量，將甘油向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而縮小了脂肪細(xì)胞的體積，同時(shí)游離脂肪酸的水平的穩(wěn)定，不加重胰島素抵抗所帶來的對機(jī)體的損壞。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Nestel PJ， Straznicky N， Mellett NA， et al. Specific plasma lipid classes and phospholipid fatty acids indicative of dairy food consumption associate with insulin sensitivity[J].Am J Clin Nutr，2014，99（1）：46-53.

[2] Thankamony A， Tossavainen PH， Sleigh A， et al. Short-term administration of pegvisomant improves hepatic insulin sensitivity and reduces soleus muscle intramyocellular lipid content in young adults with type 1 diabetes[J].J Clin Endocr inol Metab，2014，99（2）：639-647.

[3] 徐國恒.脂肪細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)油滴與肥胖和代謝綜合征[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2008，43（1）：1-5.

[4] Verkman， A.S. More than just water channels：unexpected cellular roles of aquaporins[J].Cell Sci，2005，118（15）：3225-3232.

[5] Appel SJ，Jones ED.Kennedy-Malone L Central obesity and the metabolic syndrome：implications for primary care provid-ers[J].Am Acad Nurse Pract，2004，16（8）：335-342.

[6] 白曉蘇，陸澤元，邵豪.含有 ap 2 啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、 AQP7c DNA 的腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定[J]. 醫(yī)學(xué)臨床研究， 2014，31（5）：856-858.

[7] Sjholm K，Palming J，Olofsson LE， et al. A microarray search for genes predominantly expressed in human omental adipocytes： adipose tissue as a major production site of serum amyloid A[J].Clin Endocrinol Metab，2005，90（4）：2233-2239.

[8] Maeda N， Funahashi T， Hibuse T，et al.Adaptation to fasting by glycerol transport through aquaporin 7 in adipose tissue[J].Proc Natl Acad Sci USA，2004，101：17801-17806.

[9] Arner P， Rydén M.Fatty Acids， Obesity and Insulin Resist ance[J].Obes Facts，2015，8（2）：147-155.

（收稿日期：2017-10-24）