大鼠附睪上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及純化鑒定

程胖，劉博，馮瀟，魏金花，馬斌芳，李臻

（第四軍醫(yī)大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，西安，710032）

附睪作為精子成熟與貯存的場所，其特定的管腔酸性微環(huán)境對精子的成熟至關(guān)重要，而附睪上皮細(xì)胞可以通過多種酸堿轉(zhuǎn)運體調(diào)節(jié)水分、HCO3-的重吸收和質(zhì)子的分泌，共同維持附睪管腔酸性微環(huán)境的平衡[1,2]。組成附睪上皮的細(xì)胞類型主要包括分布于整段附睪的主細(xì)胞、基細(xì)胞和具有區(qū)段特異性的亮細(xì)胞、狹窄細(xì)胞及少量的頂細(xì)胞等，主細(xì)胞數(shù)量約占所有附睪上皮細(xì)胞的80%，是附睪上皮中最主要的細(xì)胞類型[3]。附睪上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)，有利于附睪上皮的功能研究深入。本實驗采用酶消化法和組織塊法對大鼠附睪上皮細(xì)胞進行了原代培養(yǎng)，然后對細(xì)胞進行了純化并和鑒定，最后檢測了相關(guān)分子如雄激素受體（androgen receptor, AR）和雌激素受體α（estrogen receptor α, ERα）在原代培養(yǎng)的附睪上皮細(xì)胞的表達情況。通過對兩種培養(yǎng)方法的觀察、比較，我們篩選出了更適合、有效的培養(yǎng)方法，從而為體外研究附睪上皮細(xì)胞的功能奠定了基礎(chǔ)。

材料與方法

1 實驗動物

健康雄性SD大鼠，4～5周齡，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。

2 主要試劑

MEM培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司），5α-DHT、丙酮酸鈉（sigma公司），無Ca2+、Mg2+的PBS，胰蛋白酶（Gibco公司），I型膠原酶（Gibco公司），兔抗Clusterin多克隆抗體（Novus公司），兔抗AR多克隆抗體（Santa Cruz公司）和兔抗ERα多克隆抗體（Abcam公司），Alexa488標(biāo)記羊抗兔IgG（Invitrogen公司），生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG（中杉金橋）。

3 大鼠附睪的采集

用2%戊巴比妥鈉麻醉4～5周齡的SD大鼠，消毒腹部，打開腹腔，無菌條件下取雙側(cè)附睪組織，置于無Ca2+、Mg2+的含青-鏈霉素雙抗的PBS中,充分漂洗。

4 附睪上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)

將沖洗好的附睪組織置于平皿中，用眼科剪和眼科鑷盡量分離干凈周圍的脂肪組織和結(jié)締組織，然后剪碎成糜狀，分兩部分分別用于酶消化法培養(yǎng)和組織塊法培養(yǎng)。

酶消化法：將剪碎的組織置于15ml離心管中，先加入0.25%胰蛋白酶消化10min，1000g 離心5min，去除上清，再加入0.25%I型膠原酶消化15～20min，待組織成糜狀后，1000g 離心5min，去上清。用含1mmol/L丙酮酸鈉、1nmol/L 5α-DHT、100 IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素及10% FBS的MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于60mm培養(yǎng)皿中。置于32℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6h后將未貼壁的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的60mm培養(yǎng)皿繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，棄掉6h前貼壁的細(xì)胞[4,5]。次日換液，2d左右細(xì)胞即可形成單層進行傳代。

組織塊培養(yǎng)法：將1mm3大小的組織塊以0.5cm的間距貼于培養(yǎng)皿中，每個組織塊上滴加一滴培養(yǎng)液濕潤組織，放置好后，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使皿底朝上，置32℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱4～5h，使組織塊略微干涸。然后輕輕加入適量（約2mm高）培養(yǎng)液，靜置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h，培養(yǎng)基變黃時換液。培養(yǎng)至2～3d時即有成纖維細(xì)胞遷出，3～5d左右上皮細(xì)胞逐漸遷出。待細(xì)胞形成單層后即可傳代。

5 細(xì)胞的傳代及純化

酶消化法的細(xì)胞純化：酶消化法的細(xì)胞在接種后，已根據(jù)細(xì)胞貼壁時間的差異進行了初步純化。待細(xì)胞長滿形成單層時，進一步利用兩步消化法純化附睪上皮細(xì)胞。首先吸除培養(yǎng)液，用無Ca2+、Mg2+的PBS漂洗以除去殘余培養(yǎng)基，然后加入1ml 0.25%的胰蛋白酶消化1～2min，輕彈皿底，使先被消化下來的成纖維細(xì)胞游浮于消化液中，吸棄消化液；再向皿中加入1ml 0.25%胰蛋白酶繼續(xù)消化，3～5min后加入1ml含血清的MEM培養(yǎng)基終止消化。將消化液移入無菌離心管中，1000g離心5min，棄上清，細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于60mm的培養(yǎng)皿中或24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)。

組織塊法的細(xì)胞純化：培養(yǎng)約一周時，組織塊周圍遷移出的細(xì)胞基本鋪滿皿底，可進行傳代培養(yǎng)。此時，成纖維細(xì)胞和附睪上皮細(xì)胞混雜生長。用兩步消化法純化附睪上皮細(xì)胞，方法同上。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞鋪滿或呈80%～90%匯合度時，繼續(xù)傳代純化。

6 附睪上皮細(xì)胞的鑒定

經(jīng)傳代、純化后得到的細(xì)胞大多成圓形或多角形，匯合后形成鋪路石樣形狀。利用細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)對所得細(xì)胞進行鑒定，待24孔板中的細(xì)胞長至50%～60%時（不要過密以免細(xì)胞重疊），用PBS輕柔洗3遍以去除漂浮的死細(xì)胞，然后在24孔內(nèi)加入1ml 4%的多聚甲醛進行細(xì)胞固定。30min后，吸棄固定液，室溫自然晾干后用PBS清洗3遍；然后用山羊血清封閉30min，再依次加入兔抗Clusterin多克隆抗體（1∶100）室溫孵育2h，Alexa488標(biāo)記山羊抗兔 IgG（1∶400）室溫孵育 1h，DAPI（1∶100）孵育15min，PBS清洗后用倒置顯微鏡觀察、照相。

7 附睪上皮細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達檢測

由于附睪功能的發(fā)揮依賴于雄激素及雌激素，而該兩種激素功能的發(fā)揮依賴于與其受體結(jié)合[6,7]。因此，我們進一步利用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)分別檢測了雄激素受體（AR）和雌激素受體α（ERα）在原代培養(yǎng)的附睪上皮細(xì)胞中的表達情況。4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞、山羊血清封閉后，分別加入兔抗AR（1∶300）和兔抗 ERα（1∶100）室溫孵育 2h；然后分別加入生物素標(biāo)記的抗兔IgG（1∶500）進行二抗孵育2h；滴加適量ABC復(fù)合物，室溫孵育1h；DAB顯色，顯微鏡下觀察到棕黃色的陽性信號后立即放入蒸餾水中終止反應(yīng)。

結(jié) 果

1 酶消化法獲得的附睪上皮細(xì)胞

酶消化法6h后貼壁的細(xì)胞大多數(shù)是附睪上皮細(xì)胞，呈圓形、多角形或不規(guī)則形，其中混雜有少量梭形的成纖維細(xì)胞。2～3d后，細(xì)胞即可達到80%的匯合度。消化過程中殘留有少許未充分消化的組織小團塊，這些小團塊周圍更容易長出成團的附睪上皮細(xì)胞（圖1）。

圖1 酶消化法原代培養(yǎng)的大鼠附睪上皮細(xì)胞。比例尺，20μmFig. 1 Primary rat epididymal epithelial cells isolated through enzyme digestion. Scale bar, 20μm

2 組織塊培養(yǎng)法獲得的附睪上皮細(xì)胞

組織塊原代培養(yǎng)約7d時，遷移出的細(xì)胞基本鋪滿皿底，但是雜細(xì)胞較多，尤其是成纖維細(xì)胞生長優(yōu)勢明顯，但可根據(jù)細(xì)胞匯集方式和形態(tài)的不同進行區(qū)分。其中，附睪上皮細(xì)胞常成團生長，而成纖維細(xì)胞常呈索條狀生長，兩種細(xì)胞之間有明顯的生長界限（圖2）。

圖2 組織塊法原代培養(yǎng)的大鼠附睪上皮細(xì)胞。比例尺，20μmFig. 2 Primary rat epididymal epithelial cells isolated through tissue explant. Scale bar, 20μm

圖3 培養(yǎng)大鼠附睪上皮細(xì)胞的Clusterin免疫熒光染色鑒定。A，相差顯微鏡像；B，clusterin免疫熒光染色像；比例尺，20μmFig. 3 Clusterin staining to identify rat epididymal epithelial cells in culture. A, phase contrast; B, immunostaining of clusterin (green); scale bar, 20μm

3 附睪上皮細(xì)胞的純化及鑒定

根據(jù)附睪上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞對胰酶敏感性的差異，利用兩步消化法對原代培養(yǎng)的附睪上皮細(xì)胞進行純化。胰酶消化1～2min時即可看到成纖維細(xì)胞逐漸變圓從皿底脫落，此時上皮細(xì)胞尚未脫離皿底，故棄除第一步的消化液即可除去大部分的成纖維細(xì)胞。再次消化、離心后最終得到的細(xì)胞主要為附睪上皮細(xì)胞。組織塊法培養(yǎng)的附睪上皮細(xì)胞純化效果較差，仍殘留許多占優(yōu)勢生長的成纖維細(xì)胞。酶消化法中的成纖維細(xì)胞數(shù)量相對較少，純化效果較好（圖3 A）。

利用細(xì)胞免疫熒光染色對培養(yǎng)的上皮細(xì)胞進行鑒定，結(jié)果顯示幾乎所有的細(xì)胞的胞質(zhì)部分均呈附睪主細(xì)胞的標(biāo)記物Clusterin[8,9]陽性，由此可知培養(yǎng)得到的上皮細(xì)胞中主要是主細(xì)胞（圖3 B）。

4 AR和ERα在原代培養(yǎng)的附睪上皮中的表達

免疫組織化學(xué)染色顯示培養(yǎng)得到的大鼠附睪上皮細(xì)胞中有AR（圖4 A）和ERα（圖4 B）的表達，二者均定位于細(xì)胞核內(nèi)。

討 論

附睪是精子成熟、獲得受精能力、儲存和保護精子的重要器官[10]。附睪上皮細(xì)胞的緊密連接參與形成血-附睪屏障，可以保護成熟中的精子不受外界干擾，并將精子與自身免疫系統(tǒng)隔離[11]。另外，附睪上皮細(xì)胞也可通過多種酸堿轉(zhuǎn)運體調(diào)節(jié)水分和HC的重吸收以及質(zhì)子的分泌，使附睪形成了一個特異的管腔微環(huán)境，從而有利于精子的成熟和靜息狀態(tài)的維持[2,12]。除此之外，附睪上皮細(xì)胞尤其是主細(xì)胞，可以分泌大量蛋白進入附睪管腔，對精子成熟和受精能力的獲得也是至關(guān)重要的[11,13,14]。主細(xì)胞是附睪上皮中數(shù)量最多的一種細(xì)胞類型，在原代及培養(yǎng)傳代過程中會逐漸形成生長優(yōu)勢，因此可用主細(xì)胞的標(biāo)記物檢測原代培養(yǎng)的細(xì)胞是否為附睪上皮細(xì)胞。附睪上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)模式的建立，也將促進對附睪體內(nèi)生化過程的了解，最終促進附睪功能研究的進展。

圖4 大鼠附睪上皮細(xì)胞核中AR（A）和ERα（B）的免疫細(xì)胞化學(xué)定位。比例尺，20μmFig. 4 The AR (A) and ERα (B) localizations in the nuclei of rat epididymal epithelial cells were indicated by immunohistochemistry. Scale bar, 20μm

本實驗選取4～5周齡的未成熟大鼠進行附睪上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)，可以避免精子對附睪上皮細(xì)胞貼壁的阻礙作用[5]。另外，我們采用酶消化法和組織塊培養(yǎng)法對大鼠附睪上皮細(xì)胞進行原代培養(yǎng)并對兩種培養(yǎng)方法進行比較。酶消化法采取胰酶和膠原酶分步消化的方法，消化時間與組織塊剪碎的程度等密切相關(guān)，消化過度易導(dǎo)致細(xì)胞貼壁率低，應(yīng)實時觀察消化狀態(tài)對消化時間進行調(diào)整。在酶消化法過程中，我們又利用成纖維細(xì)胞比上皮細(xì)胞貼壁快這一特點，采用差速貼壁的方法使二者分離，從而減少上皮細(xì)胞中的雜細(xì)胞。在細(xì)胞傳代時，進一步根據(jù)成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞對胰酶敏感性的差異再次純化細(xì)胞，從而得到純度較高的附睪上皮細(xì)胞。采用組織塊法培養(yǎng)時，要嚴(yán)格掌握培養(yǎng)液用量，過多易導(dǎo)致植塊漂浮，過少則使植塊干涸。本實驗采取先在植塊上滴加一滴培養(yǎng)液略微覆蓋植塊，待植塊周圍的培養(yǎng)液微干涸之前，補加適量的培養(yǎng)液，可顯著降低植塊漂浮率。與酶消化法相比，組織塊法能夠減少胰酶對細(xì)胞貼壁的影響，但上皮細(xì)胞遷出緩慢，一般3～5d后才開始有細(xì)胞遷出，形成單層細(xì)胞則至少需要1周左右，且混合有大量的成纖維細(xì)胞，不利于后期上皮細(xì)胞的純化。綜合比較兩種原代培養(yǎng)方法，建議采用差速貼壁的酶消化法進行培養(yǎng)。

AR和ERα在原代培養(yǎng)的大鼠附睪上皮細(xì)胞中均有表達，提示該細(xì)胞具有對雄激素和雌激素反應(yīng)的能力，故原代培養(yǎng)的附睪上皮細(xì)胞將為體外研究這兩種激素在雄性生殖系統(tǒng)的功能提供有利幫助。目前，一些附睪上皮細(xì)胞系雖已成功建立，但這些細(xì)胞系也存在一定的缺陷，例如已得到的大鼠附睪頭部細(xì)胞系RCE中，由于AR表達水平較低導(dǎo)致該細(xì)胞對雄激素的敏感性降低[15]。雖然原代培養(yǎng)的細(xì)胞不具備細(xì)胞系可以大量增殖的特點，但因與體內(nèi)環(huán)境更為接近，可以更有效地研究附睪的功能，且已有報道證明適宜濃度的海藻糖可以增加小鼠附睪上皮細(xì)胞的增殖潛力[16]，在后續(xù)的研究中我們亦可添加不同濃度的海藻糖，探索適合大鼠附睪上皮細(xì)胞生長的最佳反應(yīng)體系。

綜上所述，我們比較了大鼠附睪上皮細(xì)胞的兩種原代培養(yǎng)方法，即組織塊培養(yǎng)和酶消化法培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)酶消化法結(jié)合差速貼壁法和傳代培養(yǎng)時的兩步消化法能夠較快地得到純度高的附睪上皮細(xì)胞。雖然我們成功建立了附睪上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)體系，但其培養(yǎng)體系仍有待繼續(xù)優(yōu)化，以延長其存活時間和增殖代數(shù)，從而為更好地進行附睪功能的體外研究奠定基礎(chǔ)。