上調(diào)miR-200c通過抑制TGF-β1/Smad3通路減輕單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎纖維化

任德偉，鐘錦 ，楊敬

（重慶市中醫(yī)院腎內(nèi)科，重慶40000）

腎纖維化是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎病的共同途徑，是由多種細(xì)胞因子介導(dǎo)、多信號(hào)通路參與的病理過程，以細(xì)胞外基質(zhì)成分過度沉積和腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生導(dǎo)致的腎臟結(jié)構(gòu)破壞、功能喪失為特征[1]。微小RNA（microRNA, miRNA）是一類短鏈小分子非編碼RNA，廣泛參與腎臟的生理和病理過程[2]。miR-200c是miR-200家族重要成員之一，其位于染色體12p13.31上，較多的研究發(fā)現(xiàn)，器官纖維化時(shí)miR-200c表達(dá)明顯下調(diào)，如miR-200c在肺[3]、腹膜[4]、皮膚[5]等器官纖維化時(shí)表達(dá)均明顯降低，但至今有關(guān)miR-200c與腎臟纖維化關(guān)系的研究甚少，并且作用機(jī)制尚不清楚。TGF-β/Smad信號(hào)通路與臟器纖維化的關(guān)系密切，TGF-β1和Smad3是TGF-β/Smad信號(hào)通路最重要的調(diào)控因子，在臟器纖維化中起促進(jìn)作用[6,7]。研究證實(shí)miR-200c可以調(diào)控TGF-β1/Smad3信號(hào)通路參與機(jī)體生理和病理過程[8]。單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstmction,UUO）可以導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型出現(xiàn)腎纖維化，是目前研究腎纖維化最常用的方法[9]。本研究通過建立UUO腎間質(zhì)纖維化小鼠模型，觀察miR-200c在UUO小鼠腎組織中的表達(dá)變化及其對(duì)UUO小鼠腎間質(zhì)纖維化和TGF-β1/Smad3通路的影響。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠45只，體重21～26g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。于室溫安靜環(huán)境下常規(guī)飼養(yǎng)，晝夜交替，自由飲食飲水，適應(yīng)環(huán)境1w。本研究中所有動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

2 藥物與試劑

Scr和BUN 測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Allin-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit和All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司；agomir-200c、miR-200c和U6引物購(gòu)自上海生工生物工程公司；Masson 染色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物公司；一抗TGF-β1、Smad3、α-SMA抗體、GAPDH抗體和HRP標(biāo)記的二抗均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

3 UUO模型制備、分組及取材

所有C57BL/6J小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假UUO組、UUO組、UUO+agomiR-200c組，每組15只。UUO組和UUO+agomiR-200c組參考文獻(xiàn)[10,11]通過結(jié)扎左側(cè)輸尿管建立的腎纖維化模型：5%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠后，切開腹腔暴露左腎，游離左輸尿管，于腎門處結(jié)扎輸尿管，于輸尿管的遠(yuǎn)離腎門處二次結(jié)扎，在兩處結(jié)扎中間離斷輸尿管后縫合腹腔。假UUO組僅游離左側(cè)輸尿管，但不進(jìn)行結(jié)扎和離斷輸尿管的操作；手術(shù)操作均嚴(yán)格按無(wú)菌原則進(jìn)行。UUO+agomiR-200c組于手術(shù)后第1、7、14d給予30mg/kg的agomir-200c尾靜脈注射，UUO 組以等量生理鹽水尾靜脈注射。在建立模型后21d麻醉處死所有小鼠，心臟取血，用于測(cè)定SCr和BUN。取小鼠梗阻側(cè)腎臟組織，留取一半腎組織，4%甲醛溶液固定，用于病理染色；剩余組織置于液氮中速凍后置于-80℃低溫冰箱保存，用于qRT-PCR和Western blotting的檢測(cè)。

4 血測(cè)定血肌酐和血尿素氮檢測(cè)

麻醉處死小鼠后心臟取血，離心取上層血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血測(cè)定血肌酐（Scr）、和血尿素氮（BUN）的水平。

5 qRT-PCR檢測(cè)腎組織miR-200c的表達(dá)

取凍存的小鼠腎組織勻漿后，RNA的抽取按照TRIzol試劑說明書進(jìn)行，并使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定總RNA質(zhì)量。取總RNA，按照cDNA合成試劑盒說明書操作逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，參照qPCR試劑盒說明書配置PCR體系后，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行qPCR,PCR循環(huán)條件：95℃，10min；45個(gè)循環(huán)（95℃，10s，60℃，20s，72℃，10s）。以 U6作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-200c相對(duì)表達(dá)量。

6 腎組織病理性檢查

腎組織經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)酒精脫水、二甲苯透明，石蠟包埋后切5μm厚石蠟片，經(jīng)過脫蠟、浸泡等常規(guī)處理后HE染色及Masson染色，光鏡下觀察腎臟組織的病理學(xué)改變。腎小管間質(zhì)損傷病理評(píng)分采用半定量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分[12], 進(jìn)行半定量分析，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，腎小球無(wú)病變；1分，腎小球病變面積＜25%；2分，腎小球病變面積25%～50%；3分，腎小球病變面積51%～75%；4分，腎小球病變面積＞75%。參考文獻(xiàn)[13]依據(jù)Masson染色結(jié)果每例切片隨機(jī)選取10個(gè)腎小管間質(zhì)不重復(fù)視野，計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF），藍(lán)色膠原沉積為Masson陽(yáng)性染色，CVF=膠原面積/腎間質(zhì)總面積，腎間質(zhì)總面積為除去腎小管管腔面積后的腎間質(zhì)面積。

7 Western blotting檢測(cè)腎組織TGF-β1、Smad3及α-SMA水平

取凍存的小鼠腎組織用RIPA裂解，離心取裂解上清液，二喹啉甲酸（BCA）法進(jìn)行蛋白濃度定量。蛋白上樣，SDS-Page電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。室溫脫脂奶粉封閉1h后加入一抗（TGF-β1、Smad3、α-SMA抗體及GAPDH抗體）, 4℃孵育過夜，TBST洗3次后再加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，洗滌3次后，ECL顯像曝光后凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，采用Quality one進(jìn)行條帶光密度值測(cè)定，應(yīng)用GADPH作為內(nèi)參，以目的條帶光密度值與內(nèi)參條帶光密度值的比值表示蛋白相對(duì)水平。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（ˉx±s）表示，比較采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)，P＜0.05表示為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 單側(cè)輸尿管梗阻降低腎組織中miR-200c表達(dá)水平

為了觀察單側(cè)輸尿管梗阻性小鼠腎組織中miR-200c的表達(dá)變化，應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)腎組織miR-200c表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與假UUO組比較，UUO組小鼠腎組織miR-200c的表達(dá)水平較假UUO組明顯降低；UUO+agomiR-200c組小鼠腎組織miR-200c的表達(dá)明顯高于UUO組（圖1）。由此表明，agomiR-200c能夠糾正UUO小鼠腎組織中miR-200c表達(dá)的降低。

2 過表達(dá)miR-200c減輕單側(cè)輸尿管梗阻性腎功能損傷

為了觀察過表達(dá)miR-200c對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻性腎功能損傷的影響，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清Scr和BUN，結(jié)果顯示，與假UUO組比較，UUO組小鼠血清Scr和BUN水平較假UUO組明顯升高，UUO+agomiR-200c組小鼠血清Scr和BUN水平明顯低于UUO組（表1）。由此表明，過表達(dá)miR-200c能減輕單側(cè)輸尿管梗阻性腎功能損傷。

圖1 單側(cè)輸尿管梗阻對(duì)腎組織中miR-200c表達(dá)的影響。A，假UUO組；B，UUO組；C，UUO+agomiR-200c組；與假UUO組比較：#P＜0.01；與UUO組比較：*P＜0.01Fig.1 The effect of unilateral ureteral obstruction on the expression level of miR-200 in renal tissue. A, Sham UUO group; B, UUO group;C, UUO+agomiR-200c group; #, P＜0.01, compare with the sham UUO group; *, P＜0.01, compare with the UUO group

表1 過表達(dá)miR-200c對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻性腎功能損傷的影響Tab. 1 The effect of miR-200c upregulation on the renal functions of mice with unilateral ureteral obstruction

3 過表達(dá)miR-200c降低單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎小管間質(zhì)損傷病理評(píng)分及腎膠原容積分?jǐn)?shù)

肉眼觀，假UUO組小鼠腎臟形態(tài)色澤正常，左腎（梗阻側(cè)腎）與右腎無(wú)明顯差別。UUO組和UUO+agomiR-200c組小鼠左腎（梗阻側(cè)腎）表面血管增粗，包膜緊張，左腎明顯大于右腎，并且左腎較右腎顏色變淺；UUO+agomiR-200c組小鼠腎臟形態(tài)學(xué)改變較UUO組明顯減輕。

HE染色顯示，假UUO組小鼠腎小球、腎小管及腎間質(zhì)正常，未見明顯損傷表現(xiàn)；UUO組小鼠腎臟可見腎小管管腔擴(kuò)張明顯，腎間質(zhì)增寬，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；UUO+agomiR-200c組小鼠腎臟病理性改變較UUO組明顯減輕（圖2）。計(jì)算腎小管間質(zhì)損傷病理評(píng)分結(jié)果顯示：與假UUO組比較，UUO組小鼠腎小管間質(zhì)損傷病理評(píng)分較假UUO組明顯增加；UUO+agomiR-200c組小鼠腎小管間質(zhì)損傷病理評(píng)分明顯低于UUO組（圖3）。由此表明，過表達(dá)miR-200c能降低單側(cè)輸尿管梗阻性小鼠腎小管間質(zhì)損傷病理評(píng)分。

圖2 過表達(dá)miR-200c對(duì)小鼠單側(cè)輸尿管梗阻性腎病理變化影響的HE染色檢測(cè)。A，假UUO組；B，UUO組；C，UUO+agomiR-200c組；比例尺，50μmFig. 2 HE staining to observe the effect of miR-200c upregulation on the pathological changes of renal tissues in mice with unilateral ureteral obstruction. A, Sham UUO group; B, UUO group; C, UUO+agomiR-200c group; scale bar, 50μm

圖3 腎小管間質(zhì)損傷病理評(píng)分。A，假UUO組；B，UUO組；C，UUO+agomiR-200c組；與假UUO組比較：#P＜0.01；與UUO組比較：*P＜0.01Fig. 3 Pathological score of renal tubulointerstitial injury. A, Sham UUO group; B, UUO group; C，UUO+agomiR-200c group; #, P＜0.01, compare with the sham UUO group; *, P＜0.01, compare with the UUO group

Masson染色檢測(cè)顯示，假UUO組小鼠腎組織Masson陽(yáng)性染色正常，主要分布于腎小管基膜、系膜區(qū)和腎小管毛細(xì)血管周圍；UUO組小鼠腎間質(zhì)中膠原纖維（藍(lán)染）明顯增多；UUO+agomiR-200c組小鼠腎間質(zhì)中膠原纖維（藍(lán)染）較UUO組明顯減少（圖4）。計(jì)算腎膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）結(jié)果顯示：與假UUO組比較，UUO組小鼠CVF較假UUO組明顯增加；UUO+agomiR-200c組小鼠CVF明顯低于UUO組（圖5）。由此表明，過表達(dá)miR-200c能降低單側(cè)輸尿管梗阻性小鼠腎膠原容積分?jǐn)?shù)。

圖5 Masson染色膠原容積分?jǐn)?shù)。A，假UUO組；B，UUO組；C，UUO+agomiR-200c組；與假UUO組比較：#P＜0.01；與UUO組比較：*P＜0.01Fig. 5 Collagen volume fraction in Masson staining. A, Sham UUO group; B, UUO group; C, UUO+agomiR-200c group; #, P＜0.01, compare with the sham UUO group; *, P＜0.01, compare with the UUO group

圖4 過表達(dá)miR-200c對(duì)小鼠單側(cè)輸尿管梗阻性腎病理變化影響的Masson染色檢測(cè)。A，假UUO組；B，UUO組；C，UUO+agomiR-200c組；比例尺，50μmFig. 4 Effect of miR-200c upregulation on the pathological changes of renal tissues examined by Masson staining in mice with unilateral ureteral obstruction. A, Sham UUO group; B, UUO group; C, UUO+agomiR-200c group; scale bar, 50μm

4 過表達(dá)miR-200c降低單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎組織中TGF-β1、Smad3及α-SMA的上調(diào)

Western blot檢測(cè)顯示，與假UUO組比較，UUO組小鼠腎組織中TGF-β1、Smad3及α-SMA水平較假UUO組明顯升高，UUO+agomiR-200c組小鼠腎組織中TGF-β1、Smad3及α-SMA水平明顯低于UUO組（圖6）。由此可見，過表達(dá)miR-200c能降低單側(cè)輸尿管梗阻性小鼠腎組織中TGF-β1、Smad3及α-SMA水平的表達(dá)。

圖6 過表達(dá)miR-200c對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎組織中TGF-β1、Smad3及α-SMA水平的影響。A，假UUO組；B，UUO組；C，UUO+agomiR-200c組Fig. 6 The effects of miR-200c upregulation on the levels of α-SMA,TGF-β1 and Smad3 in the renal tissues of mice with unilateral ureteral obstruction. A, Sham UUO group; B, UUO group; C, UUO+agomiR-200c group

討 論

腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎病的共同病理特征，表現(xiàn)為腎臟固有細(xì)胞缺失，腎單位結(jié)構(gòu)破壞，成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞增生，生成大量細(xì)胞外基質(zhì)堆積，導(dǎo)致腎臟功能喪失。腎間質(zhì)纖維化是多種細(xì)胞因子和信號(hào)通路參與[14]，具體機(jī)制尚未完全清楚。本研究中我們建立UUO小鼠模型發(fā)現(xiàn)，小鼠梗阻側(cè)腎臟較右腎明顯增大，腎臟表面血管增粗，包膜緊張，顏色變淺，腎小管間質(zhì)損傷病理評(píng)分下降，腎膠原容積分?jǐn)?shù)（cVF）增加，腎組織中α-SMA蛋白表達(dá)水平增高，以上均提示UUO造模成功。

miRNAs是一類長(zhǎng)約18～23nt的小分子非編碼RNA，其可以通過與靶基因mRNA的3’UTR區(qū)特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，起著促進(jìn)或者抑制腎臟纖維化的作用[15]。Sun等[16]學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-181c可以通過抑制EMT減輕環(huán)孢霉素A誘導(dǎo)的腎臟損傷和纖維化。Bijkerk等[17]報(bào)道沉默miR-132的表達(dá)能夠通過抑制肌成纖維細(xì)胞的增殖減輕腎纖維化。Fang等[18]發(fā)現(xiàn)miR-382在UUO小鼠模型中表達(dá)減低，上調(diào)miR-382的表達(dá)可以通過抑制HSPD1的表達(dá)減輕腎臟纖維化進(jìn)程。本研究中我們發(fā)現(xiàn)UUO組小鼠腎組織中miR-200c的表達(dá)明顯降低，提示miR-200c可能與腎纖維化密切相關(guān)。

TGF-β1/Smad3信號(hào)通路是腎纖維化重要的調(diào)控通路。TGF-β1是一種促纖維化始動(dòng)因子，通過TGF-β1/Smads信號(hào)通路參與機(jī)體器官纖維化的調(diào)控。TGF-β1能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA而形成肌成纖維細(xì)胞，加速纖維化組織收縮，進(jìn)而加重腎組織缺血缺氧，導(dǎo)致腎纖維化，研究已證實(shí)嚙齒類動(dòng)物中過表達(dá)TGF-β1可誘導(dǎo)腎纖維化反應(yīng)[19]。腎纖維化動(dòng)物模型中也已證實(shí)TGF-β1明顯上調(diào)[20],使用TGF-β1中和抗體或使其受體的基因缺失能夠明顯減緩腎纖維化[21]。Smads是TGF-β家族信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，其中Smad3是Smads家族重要成員之一，屬于受體活化型Smad蛋白，是TGF-β1信號(hào)下游的第一個(gè)信號(hào)分子，被認(rèn)為在TGF-β1信號(hào)通路上起著必不可少的核心作用[22]。TGF-β1與細(xì)胞受體結(jié)合后活化Smad3，通過核膜進(jìn)入核內(nèi)，通過直接與DNA結(jié)合實(shí)現(xiàn)促纖維化的作用[23]。miR-200c可以調(diào)控TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，并且TGF-β1可以反過來(lái)調(diào)控miR-200c，TGF-β1可以通過誘導(dǎo)Smad3與位于miR-200c啟動(dòng)子序列上的Smad結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而抑制miR-200c表達(dá)[8]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)UUO組小鼠腎組織中TGF-β1和Smad3的表達(dá)明顯增高，而給予agomiR-200c干預(yù)的UUO小鼠腎組織中miR-200c表達(dá)明顯升高，TGF-β1和Smad3的表達(dá)明顯下降，并且血清Scr、BUN水平明顯降低，腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分明顯下降，腎膠原容積分?jǐn)?shù)減少，腎組織中α-SMA蛋白表達(dá)也明顯降低，提示miR-200c可以通過抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路活性，減輕UUO小鼠腎纖維化，從而改善腎功能。

綜上所述，本研究證實(shí)miR-200c在腎纖維化小鼠腎組織中表達(dá)明顯減低，上調(diào)miR-200c能夠通過抑制TGF-β1/Smad3通路減輕UU0小鼠腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程，可能成為腎纖維化治療的潛在靶點(diǎn)。