抑制Notch信號(hào)通路減少大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)MMP-13的上調(diào)和Col Ⅱ的降低

薛太陽(yáng)，曾娟 ，劉士嘉，田野

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院脊柱關(guān)節(jié)骨科，沈陽(yáng)110004）

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis , OA）是最常見(jiàn)的慢性關(guān)節(jié)疾病[1]，以關(guān)節(jié)軟骨退變、滑膜增生、骨贅形成以及軟骨下骨硬化為特征，臨床上主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、畸形、活動(dòng)受限等癥狀，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[2]。在所有的骨性關(guān)節(jié)炎中，膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的幾率最高[3]。雖然目前對(duì)于膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的病理生理因素沒(méi)有明確，但公認(rèn)的是膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病是多因素的。目前對(duì)于膝關(guān)節(jié)OA的治療停留在早期通過(guò)應(yīng)用非甾體抗炎藥物、關(guān)節(jié)腔注射透明質(zhì)酸等、減少運(yùn)動(dòng)量等方法來(lái)控制癥狀、延緩病情，晚期則建議進(jìn)行手術(shù)治療以改善患肢功能、提高生活質(zhì)量、矯正畸形等[4,5]。由于膝關(guān)節(jié)OA發(fā)病率的增高以及該疾病的高致殘疾率，使得對(duì)于OA病因及治療的研究越來(lái)越受到重視。目前，對(duì)于OA的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但是多數(shù)學(xué)者認(rèn)為信號(hào)通路在OA疾病發(fā)生及進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。在OA的發(fā)生與進(jìn)展過(guò)程中，存在多條信號(hào)通路的參與，包括Notch、 Wnt、OPG-RANK-RANKL、SDF-1/CXCR4及p38-MAPK等[6]，其中Notch信號(hào)通路已經(jīng)被證實(shí)在軟骨細(xì)胞增殖、分化的調(diào)控[7]、細(xì)胞外基質(zhì)的形成[8]以及維持軟骨基質(zhì)代謝平衡等方面起著十分重要的作用。

本研究通過(guò)建立大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型并對(duì)其中部分采用γ-分泌酶（γ-secretase）抑制劑(2S)-N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-2-苯基甘氨酸叔 丁 酯{（2S)-N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-2-phenylglycine tert-butyl ester，DAPT}[9]進(jìn)行膝關(guān)節(jié)腔注射以抑制Notch信號(hào)通路[10]， HE染色觀察骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的組織病理學(xué)變化，利用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinases-13, MMP-13）、Ⅱ型膠原蛋白（ type Ⅱ collagen, Col Ⅱ）免疫反應(yīng)性變化，以分析抑制Notch信號(hào)通路對(duì)骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的影響。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡雄性SD大鼠60只，體重180～200g，由本溪長(zhǎng)生公司提供 [許可證號(hào)：SCXK（遼）2015.0001]。分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周（22℃，充足食水）后隨機(jī)分為6周空白組、6周手術(shù)組、6周抑制組、8周空白組、8周手術(shù)組和8周抑制組。

2 主要試劑

兔抗鼠 MMP-13多克隆抗體（武漢博士德，BA2204），兔抗鼠Ⅱ型膠原蛋白多克隆抗體（武漢博士德，BA0533），DAPT（Selleckchem，S2215），10%中性福爾馬林（Solarbio，G2161），EDTA脫鈣液（Solarbio，E1171），HE顯色試劑盒（Solarbio，G1120），抗原修復(fù)液I（武漢博士德，AR0026），免疫組織化學(xué)試劑盒（包含內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，動(dòng)物非免疫血清，生物素標(biāo)記的羊抗鼠/兔IgG，鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶；邁新試劑，KIT-9720），DAB顯色液（武漢博士德，AR1002）。

3 主要儀器及應(yīng)用軟件

組織包埋機(jī)（Leica EG1150H），石蠟切片機(jī)（Thermo Microm HM340E，切片機(jī)刀片Leica 819），全自動(dòng)過(guò)缸染色機(jī)（Leica Autostainer XL），恒溫箱（天津泰斯特 DH4000），顯微鏡（Nikon E800），圖像采集軟件 （NIS-Elements F3.0，Nikon），圖像分析軟件（NIS-Elements Br3.0，Nikon）。

4 膝骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型建立與干預(yù)

將大鼠腹腔注射10%水合氯醛[11]進(jìn)行麻醉，右后肢膝關(guān)節(jié)進(jìn)行手術(shù)切斷前交叉韌帶，行前抽屜試驗(yàn)確定前交叉韌帶完全切斷，清理殘端，股骨端切斷內(nèi)側(cè)副韌帶并摘除內(nèi)側(cè)半月板[12]，手術(shù)過(guò)程中注意保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，生理鹽水棉球止血，縫合，消毒。術(shù)后光照2h保持體溫待大鼠蘇醒后單獨(dú)放置于籠中，允許正?；顒?dòng)，常規(guī)飼食水。于術(shù)后2周，大鼠右后肢著地可用力后，6周抑制組及8周抑制組大鼠右后肢膝關(guān)節(jié)腔注射DAPT（100ng/kg），6周手術(shù)組及8周手術(shù)組右后肢膝關(guān)節(jié)注射等體積生理鹽水，每周兩次?？瞻捉M不進(jìn)行干預(yù)。

5 標(biāo)本采集與石蠟包埋

術(shù)后6周和8周分別處死相應(yīng)組別大鼠，截取右后肢膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)側(cè)髁，入10%中性福爾馬林固定72h，PBS液沖洗，EDTA脫鈣液浸泡1個(gè)月，其間1周更換一次脫鈣液，脫鈣后流水沖洗10min，順序置入50%乙醇2h、75%乙醇2h、95%乙醇2h、無(wú)水乙醇I 2h、無(wú)水乙醇II 2h、二甲苯I 30min、二甲苯II 30min、65℃石蠟液I 1h、65℃石蠟液II 1h，石蠟包埋機(jī)包埋。

6 HE染色

包埋后的標(biāo)本用切片機(jī)切4μm標(biāo)本切片，撈片、烤片、65℃恒溫箱過(guò)夜，脫蠟、脫苯、至水。滴加蘇木素5min染色后甩去，滴加分化液30s，自來(lái)水返藍(lán)10min，滴加伊紅液2min，自來(lái)水沖洗10min。脫水、透明、中性樹(shù)膠及蓋玻片封片。

7 基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP-13）免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

包埋后的標(biāo)本以切片機(jī)切4μm標(biāo)本切片，撈片、烤片、65℃恒溫箱過(guò)夜，脫蠟、脫苯、至水?？乖迯?fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)（37℃，30min），PBS液沖洗3次，滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑（室溫30min），PBS液沖洗3次，滴加非免疫血清室溫孵育30min，甩去，滴加 MMP-13（1∶150）或 ColⅡ（1∶20），4℃過(guò)夜，PBS液沖洗3次，滴加生物素標(biāo)記的二抗（室溫30min），PBS液沖洗3次，滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶（室溫30min），PBS沖洗3次，滴加DAB顯色液至鏡下開(kāi)始顯色，水洗，蘇木素染色5min，流水返藍(lán)10min。脫水、透明、中性樹(shù)膠及蓋玻片封片。以40倍物鏡下拍照，通過(guò)圖像分析軟件NIS-Elements Br 3.0進(jìn)行圖像分析，以光密度值（optical density，OD）作為MMP-13或Col Ⅱ免疫反應(yīng)性強(qiáng)弱指標(biāo)。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。全部數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P ＜ 0.05為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 DAPT 抑制骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)損害

HE染色檢測(cè)顯示（圖1），正常（空白組）大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨面平整，四層軟骨結(jié)構(gòu)及潮線清晰，軟骨細(xì)胞排列整齊；6周手術(shù)組膝關(guān)節(jié)軟骨面不規(guī)則，有小裂紋及破潰，潮線識(shí)別度較差，四層軟骨結(jié)構(gòu)欠清晰，軟骨細(xì)胞中度增生；6周抑制組膝關(guān)節(jié)軟骨面略粗糙，可見(jiàn)裂紋及破潰，4層軟骨結(jié)構(gòu)可辨別，潮線可識(shí)別，軟骨細(xì)胞輕度增生，排列尚可；8周手術(shù)組軟骨面嚴(yán)重不規(guī)則，裂紋及破潰可達(dá)深層，潮線及四層軟骨結(jié)構(gòu)無(wú)法辨別，軟骨細(xì)胞大量減少，出現(xiàn)局部增生，排列紊亂；8周抑制組軟骨面不規(guī)則，有較大裂紋及破潰，潮線識(shí)別度差，4層軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，軟骨細(xì)胞彌漫增生，細(xì)胞排列紊亂。8周手術(shù)組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨破壞較6周手術(shù)組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨破壞程度嚴(yán)重，6周抑制組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨破壞較6周抑制組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨破壞嚴(yán)重程度減輕，8周抑制組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨破壞較8周手術(shù)組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨破壞程度減輕。

2 DAPT抑制骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)MMP-13免疫反應(yīng)性增強(qiáng)

應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)對(duì)各組軟骨內(nèi)MMP-3免疫反應(yīng)性進(jìn)行比較顯示（圖2，圖3）： 8周空白組與6周空白組比較無(wú)明顯差異，8周手術(shù)組較6周手術(shù)組明顯增強(qiáng)，6周手術(shù)組較6周空白組明顯增強(qiáng)，8周手術(shù)組較8周空白組明顯增強(qiáng)，6周抑制組和8周抑制組分別較6周手術(shù)組和8周手術(shù)組減弱，說(shuō)明骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中MMP-13免疫反應(yīng)性與骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，抑制Notch信號(hào)通路可顯著抑制骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中MMP-13免疫反應(yīng)性的增強(qiáng)。

圖3 DAPT處理對(duì)骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)MMP-3免疫反應(yīng)性影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。*，P＜0.01Fig. 3 Statistical analysis of the MMP-13 levels in articular cartilage of rat knee osteoarthritis among different treatment groups. *, P＜0.01

3 DAPT 抑制骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白減少

應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)對(duì)各組軟骨內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白免疫反應(yīng)性進(jìn)行比較顯示（圖4，圖5）： 8周空白組與6周空白組比較無(wú)明顯差異，8周手術(shù)組較6周手術(shù)組明顯降低，6周手術(shù)組較6周空白組明顯降低，8周手術(shù)組較8周空白組明顯降低，6周抑制組和8周抑制組分別較6周手術(shù)組和8周手術(shù)組增強(qiáng)，說(shuō)明骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中Ⅱ型膠原蛋白免疫反應(yīng)性與骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，抑制Notch信號(hào)通路可顯著抑制骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中Ⅱ型膠原蛋白免疫反應(yīng)性的降低。

圖5 DAPT處理對(duì)骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)Col Ⅱ免疫反應(yīng)性影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。*，P＜0.01Fig. 5 Statistical analysis of the Col II levels in the articular cartilage of rat knee osteoarthritis among different treatment groups. *, P＜0.01

圖1 DAPT處理對(duì)骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)影響的HE染色檢測(cè)。比例尺，200μmFig. 1 The effect of DAPT on the histopathology of articular cartilage was evaluated by HE staining in rat knee osteoarthritis. Scale bar, 200μm

討 論

與正常人相比，OA患者關(guān)節(jié)滑膜中Notch受體表達(dá)的類型差異明顯[13]。Notch信號(hào)通路在OA軟骨中特異性表達(dá)，通過(guò)對(duì)于基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，使OA呈現(xiàn)出不同的表型[14]；VEGF信號(hào)通路以及Notch信號(hào)通路進(jìn)行聯(lián)合調(diào)控對(duì)PMSCs的軟骨修復(fù)有協(xié)同作用[15]?？梢?jiàn)Notch信號(hào)通路在軟骨細(xì)胞分化調(diào)控方面起到的作用十分復(fù)雜[16]，其作用可能是雙向的[17]。目前文獻(xiàn)報(bào)道Notch信號(hào)通路作用的在體研究較少，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠模型并使用DAPT進(jìn)行大鼠膝關(guān)節(jié)腔注射來(lái)抑制Notch通路以探究Notch信號(hào)通路抑制后大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展情況。

圖2 DAPT處理對(duì)骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)MMP-13水平影響的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。比例尺，200μmFig. 2 The effect of DAPT on MMP-13 level in the articular cartilage of rat knee osteoarthritis was assessed using immunohistochemistry. Scale bar,200μm

由于倫理原則等原因，對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎及防治方法的在體研究主要依賴于動(dòng)物OA模型。鼠類關(guān)節(jié)組織的結(jié)構(gòu)以及在患OA時(shí)關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)方面、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)等與人類患者較為相似[18]，所以多選用鼠類建立OA模型。本實(shí)驗(yàn)選用SD大鼠進(jìn)行膝骨關(guān)節(jié)炎造模，選用了半改良Hulth法，即在改良Hulth法切斷前交叉韌帶并摘除內(nèi)側(cè)半月板的基礎(chǔ)上，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，并保留了Hulth法切斷的后交叉韌帶[19]，使骨關(guān)節(jié)炎模型建立速度控制在需求范圍內(nèi)。

圖4 DAPT處理對(duì)骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白水平影響的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。比例尺，200μmFig. 4 The effect of DAPT treatment on Col Ⅱ level in the articular cartilage of rat knee osteoarthritis was evaluated by immunohistochemistry. Scale bar, 200μm

目前研究認(rèn)為基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs），尤其是MMP-13在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展過(guò)程中起重要作用[20]。軟骨細(xì)胞合成Ⅱ型膠原蛋白、蛋白多糖等并分泌到細(xì)胞外基質(zhì)，形成纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)。在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展過(guò)程中，MMP-13表達(dá)增加使得Ⅱ型膠原蛋白降解增多，Ⅱ型膠原蛋白降解與分泌失衡[21]，細(xì)胞外基質(zhì)纖維網(wǎng)架結(jié)果遭到破壞，損傷軟骨細(xì)胞。在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中，MMP-13表達(dá)與骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，而Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)程度與骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)各組軟骨細(xì)胞MMP-13及Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)情況進(jìn)行分析表明，隨著骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展，MMP-13的表達(dá)及Ⅱ型膠原蛋白破壞的增加得到了驗(yàn)證；抑制Notch信號(hào)通路后，MMP-13表達(dá)降低，Ⅱ型膠原蛋白破壞減少，骨關(guān)節(jié)炎減輕。由此可見(jiàn)，抑制Notch信號(hào)通路可能通過(guò)抑制骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)MMP-13表達(dá)的上調(diào)而減少Ⅱ型膠原蛋白降解，從而減輕骨關(guān)節(jié)炎。