中國林蛙體內重金屬與環(huán)境的相關性分析

韓曦英 朱健勛 于 澎

(長春中醫(yī)藥大學藥學院，長春，130117)

中國林蛙(Ranachensinensis)是一種名貴的野生藥用動物，主要分布于中國東北的長白山地區(qū)，為東北著名山珍。中國林蛙是食、藥兩用的珍貴蛙種，其營養(yǎng)價值高，被人們廣泛利用，特別是蛤蟆油(Ranae oviductus)，俗稱蛤螞油、雪蛤膏、哈士蟆油等，是雌蛤蟆蛙輸卵管的干制品，其味甘、咸，性平，歸肺、腎經，具有補腎益精，養(yǎng)陰潤肺之功效，用于陰虛體弱、神疲乏力、心悸失眠、盜汗不止、癆嗽咳血，自古在民間就是傳世的滋補佳品?！吨腥A人民共和國藥典》1985年版到2015年版都收錄了蛤蟆油[1]。

隨著對中國林蛙的營養(yǎng)和藥用價值越來越廣泛的認識以及人們生活水平的提高，中國林蛙的人工養(yǎng)殖正在大力開展。但是重金屬在動物體內容易發(fā)生蓄積[2-5]，生態(tài)環(huán)境的污染可能會導致環(huán)境中的一些重金屬存留在林蛙體內，影響中國林蛙的藥用、食用安全性。2014年肖井雷[6-7]等對中國林蛙體內重金屬富集特征進行了研究，同時評測了中國林蛙棲息地的環(huán)境質量，發(fā)現重金屬在中國林蛙體內有富集。

中國林蛙廣泛分布在長白山區(qū)，在吉林省吉林市、延邊州、通化市、白山市地區(qū)的林區(qū)分布廣，數量最多[8]。吉林省農業(yè)大省的經濟發(fā)展現狀和產業(yè)結構特征決定了重金屬的污染狀況較輕，在省內局部水體、土壤重金屬偶有超標現象，超標幅度較小。主要涉及地區(qū)有長春市、吉林市、四平市、通化市、白山市、白城市、延邊州地區(qū)[9]。中國林蛙在生活過程中從水和食物中吸收并積累重金屬元素。為進一步研究蛤蟆油原動物中國林蛙體內重金屬蓄積與其生存環(huán)境中水和土壤中金屬含量之間的相關關系，依照吉林省中國林蛙的主要分布地區(qū)與存在重金屬污染的地區(qū)，在吉林省境內6個不同的中國林蛙產地采集活蛙樣品以及其生存環(huán)境中的水樣和土樣進行重金屬蓄積檢測，即測定鉛、鎘、銅、汞、砷元素的含量，然后進一步用統(tǒng)計學的方法分析林蛙各部位重金屬含量與生態(tài)環(huán)境中重金屬的相關關系。其中6個采樣地點分別于吉林市豐滿區(qū)旺起鎮(zhèn)、樺甸市樺郊鄉(xiāng)、撫松縣撫南鎮(zhèn)、通化市東昌鎮(zhèn)、汪清縣東光鎮(zhèn)、安圖縣福滿溝明月鎮(zhèn)。

1 材料方法

1.1 實驗材料

在2015～2016年分別于吉林市豐滿區(qū)旺起鎮(zhèn)、樺甸市樺郊鄉(xiāng)、撫松縣撫南鎮(zhèn)、通化市東昌鎮(zhèn)、汪清縣東光鎮(zhèn)、安圖縣福滿溝明月鎮(zhèn)6個產地采集活蛙(雌蛙)樣品，分別對中國林蛙的油、肝、骨及籽4個部分中的鉛(Pb)、銅(Cu)、鎘(Cd)、砷(As)、汞(Hg)5種重金屬的含量進行測定，同時采集取樣點的中國林蛙生存環(huán)境中流動水樣、池中水水樣、土樣進行該4種重金屬蓄積檢測。

1.2 儀器和試劑

AFS-930雙道原子熒光光度計(北京吉天儀器廠)、AA-6800原子吸收分光光度計(日本島津實驗設備公司)、SX2-8-10 實驗馬弗爐(天津天有利科技有限公司)。

鹽酸、硝酸、高氯酸、硫酸、氫氧化鉀、硼氫化鉀、抗壞血酸、硫脲。

1.3 實驗方法

砷元素及汞元素采用雙道原子熒光光度計對行檢測；鉛元素、鎘元素、銅元素采用原子吸收分光光度計進行檢測[1]。

1.4 統(tǒng)計分析方法

應用偏最小二乘分析中國林蛙體內重金屬含量與其生存環(huán)境重金屬含量之間的相關關系。本文數據分析使用專業(yè)統(tǒng)計R軟件進行分析。

2 結果

2.1 重金屬檢出限與含量標準

各個重元素用相應的儀器，平行進樣得到平均值為最低檢出限。鉛、鎘、銅、砷和汞的檢出限分別為0.15 mg/L、0.01 mg/L、0.38 mg/L、0.003 mg/L、0.004 mg/L。

中國林蛙樣本檢測參照藥用植物及制劑外貿綠色行業(yè)標準WM/T2-2004，水樣檢測參照我國地表水環(huán)境質量標準GB 3838-2002，土壤檢測參照我國土壤環(huán)境質量標準GB 15618-1995，執(zhí)行二級標準。

表1 中國林蛙體內及水樣、土壤中重金屬限量

Tab.1 The limit of heavy metals in the body，water and soil for Rana chensinensis

2.2 重金屬檢測結果

經測定，中國林蛙體內各個檢測部位的鉛、銅含量符合標準；鎘在中國林蛙體內檢測部位有超標現象；砷在中國林蛙體內檢測部位基本未檢出；汞在中國林蛙體內檢測部位偶有超標。

中國林蛙體生存的水環(huán)境和土壤環(huán)境中鉛含量符合標準；水環(huán)境中銅含量有超標現象；鎘在中國林蛙生存的水環(huán)境和土壤中普遍超標；砷在水環(huán)境和土壤環(huán)境中即便偶有檢出也符合含量標準；汞在環(huán)境中偶有超標情況。

中國林蛙體內、生存水樣、土壤中的重金屬檢測結果見表2。

表2 中國林蛙體內、生存水樣、土壤中的重金屬含量

Tab.2 The quantity of heavy metals in the body，water and soil of Rana chensinensis

續(xù)表2

注：“-”表示低于檢測限；“↑”表示高于限量。表格中數字保留小數點后3位

Notes：“-” Below detection limit；“↑”Higher than limit.The number in the table is three bits after the decimal point is retained

2.3 5種重金屬在中國林蛙體內各部位與其生存環(huán)境重金屬含量之間相關分析

針對5種考察的重金屬(鉛Pb、銅Cu、鎘Cd、砷As、汞Hg)分別分析中國林蛙體內各種重金屬含量和中國林蛙生存環(huán)境中的相應重金屬含量的相關關系。

經檢驗重金屬含量數據不服從正態(tài)分布(P<0.05)，且中國林蛙各個用藥部位的重金屬含量存在嚴重的共線性(VIF>10)，即各變量之間存在顯著的相關關系使得采用普通最小二乘模型估計失真難以估計和解釋，因此采用偏最小二乘回歸分析方法進行分析。偏最小二乘方法(PLS)是一種多元統(tǒng)計分析方法，具備主成分分析、典則相關分析和普通最小二乘回歸三者的某些特點，通過建立正交得分向量(或潛變量、成分、因子)間接擬合解釋變量和反應變量之間的線性關系，能夠在變量非正態(tài)分布、存在嚴重多重相關、樣本點個數較少的條件下進行回歸建模。

表3 模型PRESS值及累積貢獻率計算結果

Tab.3 The results of the model PRESS and cumulative contribution rate

偏最小二乘回歸算法可以通過均方預測誤差根RMSEP(由留一交叉驗證法計算的均方預測誤差根)達到最小時所對應主成分數進行交叉驗證驗證成分個數選取是否合理。交叉驗證結果表明主成分個數選取2時，均方預測誤差根最小，結果見圖1。圖1中縱坐標表示均方預測誤差根，橫坐標為不同模型的成分個數。黑色實線代表留一交叉驗證時訓練樣本的均方預測誤差根，虛線代表留一交叉驗證時預測樣本的均方預測誤差根，兩條線比較接近，說明交叉驗證效果較好(限于篇幅，圖1中只表示出重金屬銅在林蛙體內與生存環(huán)境重金屬含量顯著相關的部位：林蛙骨、林蛙籽)。

圖1 成分個數選取交叉驗證結果Fig.1 Selection of cross validation results by the number of components

經偏最小二乘分析，只有重金屬銅在林蛙體內檢測部位(骨、籽)的銅含量與其生存環(huán)境的銅含量之間有顯著的相關關系(P<0.05)。文中只列出重金屬銅的相應結果。其中因變量分別為中國林蛙骨中金屬銅的含量和中國林蛙籽中金屬銅的含量，3個自變量為中國林蛙生存環(huán)境中池中水、流動水、土壤中的金屬銅的含量。偏最小二乘回歸分析中顯著的方程結果見表4。

表4 標準化偏最小二乘回歸方程

Tab.4 Standardized partial least squares regression equation

注：回歸方程中的變量均指標準化后的原始變量值

Note：The variables in the regression equation mean the normalized original variable values

由偏最小二乘分析結果可見，林蛙骨內銅的含量與其生存的池中水中銅的含量有顯著的相關關系(P=0.02399<0.05)；林蛙籽內銅的含量與其生存的流動水中的銅的含量有顯著的相關關系(P=0.0139<0.05)。

3 小結與討論

3.1 小結

中國林蛙體內及生存環(huán)境中重金屬鉛、銅、砷、汞的含量基本上符合標準，特別是砷含量大多低于檢出限；鎘元素有超標情況。中國林蛙肝臟中總重金屬含量較其他部位普遍偏高，應緣于肝臟的解毒作用，代謝過程中所產生的一些有害廢物均肝臟蓄積造成。中國林蛙體內骨、籽中的重金屬銅的含量與其生存環(huán)境池中水、流動水所含銅重金屬之間有著顯著相關關系(P<0.05)，究其原因，中國林蛙有接近半年的休眠時間，在休眠時間內中國林蛙在水下靠皮膚進行呼吸，因此造成其體內的某些部位的重金屬的含量與其生存的水環(huán)境中的銅的含量有顯著的相關關系。因此對環(huán)境中的重金屬污染進行防治、治理，有利于中國林蛙的食用和用藥安全。

3.2 討論

重金屬污染，具有隱蔽性、長期性和不可逆轉性等特點。重金屬在人體內能和蛋白質及各種酶發(fā)生強烈的相互作用，使它們失去活性，也可能在人體的某些器官中富集，如果超過人體所能耐受的限度，會造成人體急性中毒、亞急性中毒、慢性中毒等，對人體會造成很大的危害[10-13]。

中國林蛙體內重金屬含量直接影響其食用及用藥安全。以往文獻主要關注中國林蛙體內重金屬含量測定、富集特征以評價其食用用藥安全性[6，14-16]，或對中國林蛙棲息環(huán)境的質量進行評價[7]。雖然根據以往文獻調查研究發(fā)現中國林蛙體內的重金屬含量普遍符合食用用藥重金屬含量安全標準，但是探究分析中國林蛙體內重金屬相關來源、影響因素，對控制中國林蛙體內重金屬含量、提高中國林蛙用藥安全性以及進一步有針對性的防治重金屬污染都有著十分重要的意義。

文中在實驗測定中國林蛙體內重金屬含量及其生態(tài)環(huán)境中重金屬含量的基礎上，利用偏最小二乘的方法分析其重金屬含量相關性，結果兩者之間存在一定的相關關系。說明中國林蛙生存環(huán)境中的重金屬污染會在一定程度上影響中國林蛙體內的重金屬含量。因此必須通過增強環(huán)保意識，堅決杜絕工業(yè)“三廢”的排放，規(guī)劃城市垃圾的堆放，嚴格控制含有重金屬的化肥農藥的使用等，從而有效地控制環(huán)境中的重金屬污染。

偏最小二乘分析進行分析能夠克服數據非正態(tài)、樣本量小等困難進行多變量之間的相關分析，且在自身的算法中能不斷進行交叉驗證核實，具有一定的可靠性和創(chuàng)新性。該方法可以進一步地推廣應用到藥用動植物體內重金屬含量與其生存環(huán)境的重金屬含量的相關性分析。