黑斑側(cè)褶蛙Temporin基因內(nèi)含子在PCR擴(kuò)增、克隆和Sanger測(cè)序過(guò)程中的復(fù)制跳躍

崔 杰 林 煜 徐艷春 楊淑慧

(東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，哈爾濱，150040)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是指在DNA聚合酶的催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程[1]，是一項(xiàng)能夠快速、特異地在體外擴(kuò)增目的DNA的技術(shù)，是生物學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)之一[2-4]。

PCR產(chǎn)物經(jīng)常需要經(jīng)過(guò)克隆后進(jìn)行測(cè)序或其他分析?？寺r(shí)將PCR產(chǎn)物與特定載體DNA分子連接，形成重組DNA分子，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中通過(guò)細(xì)胞和質(zhì)粒的不斷復(fù)制，生成大量目標(biāo)分子[5-7]。隨著新型載體的不斷出現(xiàn)，如T-載體等，在很大程度上簡(jiǎn)化了PCR產(chǎn)物的克隆過(guò)程，同時(shí)也提高了克隆效率[8-10]。

但是，PCR并不總是完全忠實(shí)的，除了引物與模板的非特異結(jié)合產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物以外，因?yàn)槟０宓母呒?jí)結(jié)構(gòu)、聚合酶的某些屬性等，還經(jīng)常會(huì)介導(dǎo)DNA的重組(recombination)、復(fù)制滑動(dòng)(slippage)和跳躍(jumping)等[11]。

重組是DNA聚合酶在按照模板合成新鏈的時(shí)候，因?yàn)榱硪粭l與模板序列高度相似的片段與模板在空間上接近，聚合酶從原來(lái)的模板鏈上移動(dòng)到該片段上繼續(xù)合成新鏈，最終使PCR產(chǎn)物成為兩個(gè)不同模板鏈的重組產(chǎn)物[12]。復(fù)制滑動(dòng)在微衛(wèi)星等短串聯(lián)重復(fù)序列的擴(kuò)增中十分常見(jiàn)，DNA聚合酶在合成新鏈時(shí)越過(guò)一個(gè)或幾個(gè)重復(fù)單位，造成PCR產(chǎn)物比模板鏈縮短重復(fù)單位整數(shù)倍[13]。

跳躍擴(kuò)增是當(dāng)模板DNA自身因?yàn)橥蛄行纬奢^為穩(wěn)定的環(huán)形局部二級(jí)結(jié)構(gòu)，新鏈合成時(shí)DNA聚合酶移動(dòng)到該區(qū)域后，就可能跨過(guò)這個(gè)環(huán)形區(qū)繼續(xù)向下合成新鏈，從而使PCR產(chǎn)物較模板丟失了一個(gè)片段[14]。這種現(xiàn)象最早報(bào)道的是Cariello et al(1991)在擴(kuò)增人18S rDNA基因時(shí)發(fā)現(xiàn)了中間缺失54 bp的異常產(chǎn)物[15]。與微衛(wèi)星等短串聯(lián)重復(fù)序列的滑動(dòng)相比，較大片段的跳躍更難發(fā)生，在實(shí)驗(yàn)中也十分罕見(jiàn)。正因如此，PCR的跳躍問(wèn)題常常被忽視，造成錯(cuò)誤結(jié)果。

PCR產(chǎn)物的克隆是利用細(xì)菌內(nèi)的DNA聚合酶等復(fù)制體系，將目標(biāo)DNA片段進(jìn)行在體復(fù)制。因?yàn)榧?xì)菌復(fù)制體系的忠實(shí)性遠(yuǎn)高于一般的TaqDNA聚合酶(無(wú)3′-5′外切酶活性)，所以利用質(zhì)粒復(fù)制進(jìn)行分子克隆通常認(rèn)為是十分精準(zhǔn)的。然而，在特殊情況下，如目標(biāo)分子中含有某些特殊的回文結(jié)構(gòu)時(shí)，細(xì)菌質(zhì)粒在復(fù)制過(guò)程中也會(huì)出現(xiàn)跳躍或滑動(dòng)[16]。

我們?cè)谘芯亢诎邆?cè)褶蛙(Pelophylaxnigromaculatus)抗菌肽Temporin基因結(jié)構(gòu)時(shí)，曾遇到在PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物T-A克隆過(guò)程中同時(shí)出現(xiàn)跳躍而引起長(zhǎng)達(dá)560 bp的片段缺失，并發(fā)現(xiàn)與一段6 bp的重復(fù)單元有關(guān)。我們報(bào)道這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為更多的研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品

2015年，在吉林、長(zhǎng)白山、佳木斯、富錦、銀川、西安、太原等20個(gè)地區(qū)采集成年黑斑側(cè)褶蛙，每個(gè)地區(qū)采集5只，野外雙毀髓處死后立即采集后腿肌肉樣品于液氮中保存，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存。

1.2 總DNA的提取

取20 mg肌肉組織剪碎后分別加入25 μL Proteinase K(10 mg/mL)、35 μL SDS(10%)、295 μL TNE buffer(pH=8)，充分混勻后瞬時(shí)離心，56℃水浴消化1 h。消化液采用AxyPrep基因組DNA提取試劑盒(AxyPrep，杭州)提取總DNA，操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 PCR反應(yīng)

采用DNAstar軟件包的Primer Select軟件，以黑斑側(cè)褶蛙抗菌肽 Temporin基因序列為模板設(shè)計(jì)該基因內(nèi)含子的擴(kuò)增引物[17-18]，上游引物C2：GCAGCAGCTGAAACACTGAAT，下游引物D2：AGTTATACCAATTGTGTCAGGTC。反應(yīng)體系為：PimeSTAR MAX(Takara，大連)25μL，上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，DNA模板(10 ng/μL)5.0 μL，ddH2O 18 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃/5 min，(94℃/30 s，55℃/1 min，72℃/2 min)×35cycle，72℃/10 min。

1.4 PCR產(chǎn)物的克隆

PCP產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，用AxyPrep(AxyPrep，杭州)DNA純化回收試劑盒回收，用pEASY-T5 Zero試劑盒(TransGen Biotech，北京)進(jìn)行克隆，反應(yīng)體系為5 μL，組分包括PCR產(chǎn)物1～4 μL、pEASY-T5 Zero cloning vector 1 μL。在25℃恒溫條件下反應(yīng)20～30 min。轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后，在LB液體培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)過(guò)夜。陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)過(guò)1.3中相同的PCR方法鑒定后，采用Sanger法，使用M13+/M13-測(cè)序引物進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.5 質(zhì)粒提取與限制性雙酶切

取700 μL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液于2 mL離心管中10000 xg離心5 min，棄上清液。用350 μL PBS懸浮菌體細(xì)胞，具體操作按照AxyPrep質(zhì)粒小量DNA提取試劑盒(AxyPrep，杭州)使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

根據(jù)pEASY-T5 Zero cloning vector自帶酶切位點(diǎn)，采用PstI(5′...CTGCA↓G...3′)和NotI(5′...GC↓GGCCGC...3′)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶，反應(yīng)體系為：PstI 1 μL、NotI 1 μL、10 xFlyCut Buffer 5 μL、質(zhì)粒DNA 20μL和ddH2O 25 μL，37℃孵育10 min。加入10 xDNA Loading Buffer至終濃度為1 x終止反應(yīng)，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物。

1.6 測(cè)序結(jié)果分析

測(cè)得的原始序列用DNAstar軟件包中EditSeq去掉隆載體序列和引物序列。用MegAlign軟件將獲得的DNA序列與已有的參考序列進(jìn)行對(duì)比，確定序列的正確性。至少3個(gè)克隆序列完全一致時(shí)才被確定為一個(gè)最終的DNA序列。采用RepeatAround 2.1軟件查找和統(tǒng)計(jì)DNA序列中重復(fù)單元的性質(zhì)、種類和重復(fù)次數(shù)[19]。

2 結(jié)果

如圖1，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳發(fā)現(xiàn)，大約有73%的個(gè)體在1200 bp和550 bp處同時(shí)出現(xiàn)清晰的兩條帶，18%個(gè)體較短的條帶信號(hào)稍弱，9%的個(gè)體只有1200 bp的條帶。將兩處條帶分別回收后并測(cè)序，結(jié)果顯示較長(zhǎng)的條帶為1126 bp，較短的條帶為562 bp，后者是在前者198 bp處開(kāi)始缺失564 bp而成。

在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)22個(gè)個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，雖然退火溫度經(jīng)過(guò)稍許調(diào)整，使用SuperMix(TransGen Biotech，北京)、High Fidelity DNA Polymerase(TransGen Biotech，北京)、LA Taq(Takara，大連)等不同的DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)依然會(huì)有3種情況出現(xiàn)，基本沒(méi)有變化，由此將二者推斷為兩個(gè)不同的等位基因。

但在對(duì)長(zhǎng)片段進(jìn)行Sanger測(cè)序時(shí)發(fā)現(xiàn)一種異?，F(xiàn)象，模板實(shí)際長(zhǎng)度為1126 bp，但測(cè)序結(jié)果中有時(shí)會(huì)只得到562 bp的短片段序列。該短序列是長(zhǎng)片段在的198 bp處開(kāi)始缺失564 bp而成。這表明短片段極有可能是PCR造成的一種假象，即在擴(kuò)增反應(yīng)中發(fā)生了片段缺失。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)缺失來(lái)自PCR過(guò)程，我們用回收的長(zhǎng)片段作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物時(shí)發(fā)現(xiàn)3種情況，一是僅得到1126 bp的長(zhǎng)片段，一是僅得到562 bp的短片段，再者兩個(gè)片段同時(shí)出現(xiàn)(圖2)，對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序也證明了這一點(diǎn)。

圖2 以1126 bp的長(zhǎng)片段為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophorogram of the products of PCR templated with a 1126 bp fragment M為Marker DL2000，N為陰性對(duì)照(H2O)；顯示絕大多數(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物含有1126 bp的目的條帶以外，還出現(xiàn)一個(gè)短片段(測(cè)序顯示為560 bp)，否定了圖1中關(guān)于兩個(gè)等位基因的推斷 Showing that the PCR products from most samples contained two fragments，again corresponding to 1126 bp and 562 bp.This conflicts with the hypothesis that these are two different alleles because there is also a short fragment(sequencing showed 560 bp)that invalidates the deduction of two alleles as suggested by Fig 1.M is molecular marker DL2000，N is negative control(H2O)

為了完全排除模板污染的可能性，我們對(duì)長(zhǎng)片段純化回收之后進(jìn)行了T-A克隆。提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒后，用限制性內(nèi)切酶Pst I和Not I把PCR產(chǎn)物從載體上切下來(lái)，再經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性克隆中含有兩種克隆片段，一種是含有與長(zhǎng)片段完全相同的克隆片段，一種是與短片段完全相同的克隆片段(圖3)。也就是說(shuō)，1126 bp長(zhǎng)的目的片段在不同菌落中，變成大小兩種片段。測(cè)序表明，短片段仍然是長(zhǎng)片段在198 bp處缺失564 bp而成。這表明，這個(gè)1126 bp長(zhǎng)的片段不僅在PCR擴(kuò)增過(guò)程中可以發(fā)生缺失，而且在大腸桿菌內(nèi)的質(zhì)粒復(fù)制過(guò)程中也能夠發(fā)生缺失，這種現(xiàn)象十分罕見(jiàn)。

利用軟件RepeatAround 2.1對(duì)1126 bp的片段進(jìn)行重復(fù)序列分析，結(jié)果顯示，該序列具有同向重復(fù)序列(direct repeats)70種、反向重復(fù)序列(inverse repeats)13種、鏡像重復(fù)序列(mirror repeats)21種和互補(bǔ)重復(fù)序列(complementary repeats)21種(表1)。將1126 bp和526 bp的兩個(gè)片段的序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)序列在缺失片段的上游和末端，分別有一個(gè)6 bp的同向重復(fù)序列5′-AGACCT-3′(圖4)，是序列缺失發(fā)生的位置，至此我們推測(cè)DNA復(fù)制到第二個(gè)重復(fù)序列的時(shí)候發(fā)生了跳躍(PCR Jumping)。

圖3 陽(yáng)性質(zhì)粒的酶切電泳圖Fig.3 Electrophorogram electrophoresis of positive plasmids 以1126 bp片段作為插入片段在質(zhì)粒中進(jìn)行克隆后，用限制性內(nèi)切酶Pst I和Not I切割質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)插入片段在一些克隆里保持1126 bp(1中的條帶B)，而在另一些克隆里變成526 bp(2中的條帶C)，條帶A為酶切后的載體；M為Marker DL2000 While a 1126 bp fragment was cloned using pEASY-T5 Zero cloning vector，plasmids extracted from different positive clones contained two fragments of different sizes，i.e.，a 1126 bp true fragment(B)and a 526 bp pseudo-fragment generated during replication jumping(C)after double digested with the restriction enzymes Pst I and Not I.Band A is the vector，M is molecular marker DL2000

此外，序列比對(duì)還發(fā)現(xiàn)，在對(duì)應(yīng)于長(zhǎng)片段的894 bp位置開(kāi)始，有一個(gè)4 bp(5′-TGCT-3′)的短片段的插入，而且無(wú)論采用總DNA作為模板擴(kuò)增，還是采用單克隆長(zhǎng)片段作為模板擴(kuò)增，還是將單克隆長(zhǎng)片段進(jìn)行再克隆，只要出現(xiàn)片段缺失，就會(huì)出現(xiàn)這一插入序列，提示這一插入與片段缺失密切相關(guān)。

表1 黑斑側(cè)褶蛙Temporin基因內(nèi)含子1126 bp的長(zhǎng)片段中可能引起跳躍的重復(fù)序列的情況統(tǒng)計(jì)

Tab.1 Repeat sequences predicted capable of inducing replicationjumping in the 1126 bp fragment on the intron of the Temporingene of black-spotted frog(Pelophylax nigromaculatus)

續(xù)表1

3 討論

DNA序列的重復(fù)方式可以分為同向重復(fù)，反向重復(fù)，鏡像重復(fù)和互補(bǔ)重復(fù)，如果在適當(dāng)條件下形成必要的二級(jí)或更高級(jí)結(jié)構(gòu)，其中一些序列可能導(dǎo)致復(fù)制跳躍或者滑動(dòng)[20]。本研究中的1126 bp片段中檢測(cè)到665種不同的重復(fù)序列(表1)，但是多次反復(fù)擴(kuò)增中，只在第194～199 bp位置上和第757～762 bp的位置上出現(xiàn)的重復(fù)序列5′-AGACCT-3′處發(fā)生了跳躍，使得擴(kuò)增產(chǎn)物缺失了564 bp。 令人驚訝的是，由這對(duì)重復(fù)引起的跳躍在體外和體內(nèi)復(fù)制都會(huì)產(chǎn)生。

Canceill等人提出了兩種復(fù)制跳躍模型[21]。一種是與親本雙鏈形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)相關(guān)。子鏈合成在形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的堿基處被封閉，然后在雙鏈瞬時(shí)打開(kāi)后經(jīng)由DNA聚合酶的鏈置換活性繼續(xù)，最后滑過(guò)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。然而，親本雙螺旋模型似乎不適用于我們的復(fù)制跳躍事件，因?yàn)樵谖覀兊难芯恐?，子鏈中缺失了一個(gè)重復(fù)序列。這表明重復(fù)序列之一被并入發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，但是，在我們的研究中，第一次重復(fù)之后或第二次重復(fù)之前的序列都不能與重復(fù)序列形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)(圖5A和5B)。

另一種模型就是異雙螺旋模型，在第一次重復(fù)的時(shí)候阻斷了子鏈合成，同時(shí)DNA聚合酶和子鏈從模板上脫落，下一個(gè)循環(huán)中，新鏈作為互補(bǔ)鏈，與第二個(gè)重復(fù)單位相配對(duì)、退火，并成為引物，DNA聚合酶再次結(jié)合，從第二個(gè)重復(fù)單位的下游開(kāi)始完成新鏈的延伸[22]。這種情況很符合我們研究中的缺失現(xiàn)象，因?yàn)檫@種情況下子鏈中缺失一個(gè)重復(fù)序列，與我們的情況一致。我們的結(jié)果和模型之間唯一的差異是發(fā)夾底部的弱雙鏈體。據(jù)報(bào)道，DNA聚合酶的脫落和鏈延伸的阻斷可能不是真正由于發(fā)夾導(dǎo)致的，而是由DNA模板的許多二級(jí)和高級(jí)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致[22-23]。由于在DNA復(fù)制的時(shí)候出現(xiàn)了這樣的結(jié)構(gòu)，才導(dǎo)致了跳躍的發(fā)生(圖5C)。我們無(wú)法對(duì)這一預(yù)測(cè)做進(jìn)一步測(cè)試，但我們推測(cè)高級(jí)結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)的子鏈合成阻斷和聚合酶脫落都與重復(fù)序列相關(guān)，而且這種現(xiàn)象在體內(nèi)和體外復(fù)制時(shí)都會(huì)發(fā)生。

DNA聚合酶產(chǎn)生跳躍的能力與其鏈置換活性有關(guān)，鏈置換活性越高，跳躍能力越低，反之亦然[21]。在細(xì)菌體內(nèi)進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制時(shí)，DNA聚合酶III(復(fù)制早期有時(shí)是DNA聚合酶I)[24]進(jìn)行新鏈延伸時(shí)，因其鏈置換活性不是很高[25]，在遇到模板上合適的高級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)更容易脫落下來(lái)，脫落后也可以在新鏈與附近的另一個(gè)同源序列(本研究中的第二個(gè)重復(fù)單位)重新退火后再次結(jié)合上去，并完成鏈的延伸而產(chǎn)生跳躍。本研究中單克隆DNA片段再次克隆時(shí)，所發(fā)生的跳躍很可能屬于這一情形(圖5C)事實(shí)上，常用于PCR，Sanger測(cè)序或分子克隆的DNA聚合酶的類型比如TaqDNA聚合酶，DNA聚合酶II，T4聚合酶等不具有高的鏈置換活性[21，26]。 因此，當(dāng)模板序列具備促進(jìn)形成易于跳躍的高結(jié)構(gòu)，在這些酶參與復(fù)制的情況下也容易發(fā)生復(fù)制跳躍。

本研究所遇到的復(fù)制跳躍不僅發(fā)生在Temporin基因內(nèi)含子雙向擴(kuò)增中，也發(fā)生在Sanger測(cè)序時(shí)的單鏈擴(kuò)增中，甚至也發(fā)生在細(xì)菌體內(nèi)質(zhì)粒復(fù)制的過(guò)程中?；谖覀冏隽舜_認(rèn)實(shí)驗(yàn)，使用純化的1126 bp片段作為模板用于再擴(kuò)增，并且雙酶消化陽(yáng)性質(zhì)粒，得出了這個(gè)結(jié)論，否則，跳躍可能被誤解為獨(dú)立的等位基因。所以，我們建議在利用片段大小進(jìn)行二倍體或多倍體基因分型時(shí)，應(yīng)該首先選取片段較大的等位基因進(jìn)行克隆制備成單一模板，再用單一模板和已經(jīng)開(kāi)發(fā)出的具有強(qiáng)置換活性的熱穩(wěn)定DNA聚合酶[24，26]進(jìn)行PCR擴(kuò)增或再克隆后做質(zhì)粒酶切，來(lái)確認(rèn)是否發(fā)生復(fù)制跳躍，避免分型錯(cuò)誤。

圖4 Temporin基因內(nèi)含子發(fā)生復(fù)制跳躍前后的序列比較Fig.4 Allignment of the true and jumped sequences of the intron of the Temporin gene of black-spotted frog(Pelophylax nigromaculatus) TempLong為原初序列；TempShort為復(fù)制跳躍導(dǎo)致TempLong丟失了564 bp；方框中是丟失片段之前和末尾的6 bp同向重復(fù)序列，圓圈中是4 bp的插入序列 TempLong is the true sequence；TempShort is the jumped sequence from TempLong.Two 6 bp direct repeat sequences are enclosed in square boxes and the 4 bp insert is enclosed in an oval

圖5 產(chǎn)生擴(kuò)增跳躍和克隆跳躍的機(jī)制示意圖Fig.5 Schematic diagram of the mechanism of replication jumps on the intron fragment of the Temporin gene of black-spotted frog(Pelophylax nigromaculatus) A.第一個(gè)重復(fù)單位下游的序列與第二個(gè)重復(fù)單位配對(duì)后形成發(fā)夾環(huán)形結(jié)構(gòu)，DNA聚合酶直接越過(guò)發(fā)夾延伸新鏈，形成缺失的新鏈；B.第二個(gè)重復(fù)單元的下游序列與第一個(gè)重復(fù)單元配對(duì)形成一個(gè)發(fā)夾環(huán)，而DNA聚合酶將新鏈直接穿過(guò)發(fā)夾，形成一個(gè)缺失的新鏈；C.模板上兩個(gè)重復(fù)單位下相互靠近，形成特定的高級(jí)結(jié)構(gòu)，使DNA聚合酶脫落下來(lái)，新鏈延伸被阻斷。在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，下一個(gè)循環(huán)中新鏈的第一個(gè)重復(fù)單位與模板的第二個(gè)重復(fù)單位互補(bǔ)配對(duì)并退火，成為引物，DNA聚合酶結(jié)合后繼續(xù)延伸，形成缺失的PCR產(chǎn)物；在質(zhì)粒復(fù)制時(shí)，新鏈的重復(fù)單位移動(dòng)到模板的第二個(gè)重復(fù)單位并退火，DNA聚合酶再次結(jié)合并完成延伸，形成缺失的新鏈 A.The sequence downstream of the first repeat unit is paired with the second repeat unit to form a hairpin loop，and DNA polymerase extends the new strand directly across the hairpin to form a missing new strand.B.The sequence downstream of the second repeat unit is paired with the first repeat unit to form a hairpin loop，and DNA polymerase extends the new strand directly across the hairpin to form a missing new strand.C.The two repeat units of the template approach each other to form a specific high-level structure.The DNA polymerase sheds and the new chain extension is blocked.The first repeat unit of the new strand in the next cycle anneals to the second repeat unit acting as a primer for strand extension when DNA polymerase is reloaded.As a result，the segment between the two repeats is missing from the PCR product.In the case of plasmid replication，the repeat unit of the new strand moves to the second repeat unit of the template and annealed allowing reloaded DNA polymerase complete the extension that leads to the segment missing from the new strand

致謝：首先，感謝國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31370393)對(duì)本研究的大力支持。同時(shí)，感謝國(guó)家林業(yè)局野生動(dòng)物檢測(cè)中心為本研究提供實(shí)驗(yàn)設(shè)備，也感謝檢測(cè)中心馬躍老師的悉心幫助。