• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    酶解法制備牦牛骨膠原多肽及其加工性能評(píng)價(jià)

    2018-08-20 06:57:48胡迤蕭周恒量劉愛(ài)平彭露露
    關(guān)鍵詞:物質(zhì)量多肽牦牛

    劉 靜,李 誠(chéng),胡迤蕭,杜 昕, 周恒量,劉愛(ài)平,辜 雨, 彭露露

    (四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,四川 雅安 625014)

    牦牛是我國(guó)特有的家畜之一,約1 400余萬(wàn)頭,占世界總量的90%以上[1]。作為青藏高原高寒地區(qū)藏牧民不可缺少的生產(chǎn)生活資料[2],具有不可替代的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)地位[3]。牦牛肉是公認(rèn)的“綠色食品”,已被廣泛開(kāi)發(fā)利用,其加工副產(chǎn)物牦牛骨主要用于加工牦牛壯骨粉[4]、牦牛骨湯[5-6]等,未被深入研究。近年來(lái),骨膠原多肽因其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生理功能成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn),國(guó)內(nèi)外對(duì)于骨骼酶解的報(bào)道較多,集中在豬骨[7-8]、牛骨[9]、魚(yú)骨[10]等,酶解牦牛骨膠原蛋白的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。大量研究表明:酶解動(dòng)物骨蛋白得到的膠原多肽具有生物活性功能,如降血壓活性、抗腫瘤活性、抗氧化活性、預(yù)防與治療骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松活性等,且大多的活性肽都是以相對(duì)分子質(zhì)量低于5 000的小分子肽存在,多肽具有良好的食品加工特性,而且有比氨基酸和蛋白質(zhì)更好的營(yíng)養(yǎng)、吸收特性[11-14]。李帆等[15]以水解度為指標(biāo),探索木瓜蛋白酶水解牦牛骨的最佳條件,但水解度過(guò)高,蛋白質(zhì)可能被徹底水解成氨基酸從而喪失多肽的功能。因此,本實(shí)驗(yàn)與現(xiàn)有的青海牦牛骨肽產(chǎn)品[16-17]生產(chǎn)工藝相比較,以四川九龍牦牛骨為原料,考察了不同種類的蛋白酶對(duì)酶解效果的影響,首次將可溶性多肽得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo),彌補(bǔ)了單純提高水解度的不足;用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化制備牦牛骨小分子多肽得率最高的工藝條件,較大的縮短了酶解時(shí)間,并研究了酶解產(chǎn)物的加工功能特性,以期為進(jìn)一步利用牦牛骨膠原多肽開(kāi)發(fā)功能性產(chǎn)品以及探索牦牛骨多肽的生物活性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    四川九龍牦牛骨粉(200目):四川大渡河食品有限公司產(chǎn)品;胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶:上海瑞永生物科技有限公司產(chǎn)品;福林酚法蛋白檢測(cè)試劑盒:南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋:江蘇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠制造;PHS-3C型酸度計(jì):四川優(yōu)普科技有限公司產(chǎn)品;D-37520型冷凍離心機(jī)、Scientz-12型冷凍干燥機(jī):美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品;QT-2型漩渦混合器:上海琪特分析儀器有限公司產(chǎn)品;UV-3200紫外分光光度計(jì):上海美普達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 牦牛骨蛋白的酶解工藝 稱取適量牦牛骨粉→按比例加水混合均勻→121℃條件下處理30 min,冷卻、調(diào)節(jié)pH→加酶水浴酶解→100℃滅酶10 min→10 000 r/min離心10 min→上清液過(guò)濾→牦牛骨蛋白酶解液→測(cè)定其可溶性多肽含量及水解度→冷凍干燥→牦牛骨多肽粉→加工特性測(cè)定。

    1.3.2 最適蛋白酶種篩選試驗(yàn) 分別選用胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)骨粉進(jìn)行水解,以可溶性多肽得率為指標(biāo),篩選出水解度和可溶性多肽得率最高的酶。各酶的反應(yīng)條件見(jiàn)表1。

    表1 各蛋白酶反應(yīng)條件Table 1 Reaction conditions of different enzymes

    1.3.3 最優(yōu)酶酶解單因素試驗(yàn) 將牦牛骨粉樣品按比例加入蒸餾水,分別在酶底比為2 000∶1、4 000∶1、6 000∶1、8 000∶1、10 000∶1、12 000∶1 (U/g),底物質(zhì)量濃度 1、2、3、4、5、6、7 g/dL,酶解時(shí)間 3、4、5、6、7 h,酶解溫度 40、45、50、55、60 ℃,pH 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10的條件下進(jìn)行酶解單因素試驗(yàn),以多肽得率為主要指標(biāo),結(jié)合水解度篩選出最佳的酶解條件。

    1.3.4 最優(yōu)酶酶解響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取底物質(zhì)量濃度、酶底比、pH、酶解時(shí)間4因素,以多肽得率作為響應(yīng)值,采用Design expert 8.0.6Box-Behnken進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析,探索制備可溶性多肽的最佳工藝。響應(yīng)面設(shè)計(jì)如表2所示。

    表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)表Table 2 Factors and levels of RSM experiment

    1.3.5 酶解產(chǎn)物加工特性測(cè)定 對(duì)牦牛骨酶解產(chǎn)物的穩(wěn)定性、溶解性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性、乳化性及乳化穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。

    1.3.6 指標(biāo)測(cè)定

    1)酶活的測(cè)定:SB/T 10317-1999[18]

    2)水解度的測(cè)定:中性甲醛滴定法[19]

    吸取5 mL待測(cè)酶解液于250 mL燒杯中,加入60 mL蒸餾水,用磁力攪拌器攪拌并滴加0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液至溶液pH顯示8.2立刻加入5 mL甲醛,再邊攪拌邊滴加0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液至溶液pH變?yōu)?.2,記錄加入甲醛后消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積V(mL)。

    式中:N0為總氮質(zhì)量濃度 (g/dL);N1為酶解前游離氨基氮質(zhì)量濃度(g/dL);N2為酶解后游離氨基氮質(zhì)量濃度(g/dL)。

    3)可溶性多肽得率測(cè)定:使用福林酚法蛋白含量檢測(cè)試劑盒,根據(jù)魯偉[20]的方法略作修改。

    樣品的處理:取一定體積的酶解液于離心管中,加入等體積的10 g/dL三氯乙酸(TCA)水溶液,混勻,靜置 10 min,4 000 r/min下離心 15 min,取上清液備用。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液、堿性銅試劑工作液按試劑盒說(shuō)明書(shū)配置。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:取6支帶蓋1.5 mL離心管,按表3順序加入試劑。

    表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作表Table 3 Steps of making standard curve

    加入福林酚試劑混勻后于20~25℃放置30 min在750 nm下比色,以蛋白質(zhì)質(zhì)量為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    4)樣品多肽質(zhì)量的測(cè)定:取20 μL樣品溶液,按表3方法測(cè)出其吸光度值,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中多肽的質(zhì)量。

    其中,M為氮溶指數(shù);M1為濾液中的含氮質(zhì)量分?jǐn)?shù);M2為樣品總含氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

    6)穩(wěn)定性:參考趙玉紅[22]的方法,將20 mg樣品溶于10 mL 0.1 mol/L NaCl溶液中,調(diào)解pH 7。于121℃高壓蒸汽滅菌20 min后測(cè)含氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

    其中,I為可溶性的肽得率;m1為上清液中的肽質(zhì)量;m0為總蛋白質(zhì)質(zhì)量。

    5)溶解性:參考 Giménez B[21]的方法,將 20 mg樣品溶于10 mL 0.1 mol/L NaCl溶液中,調(diào)解pH 7,于30℃恒溫?fù)u床放置60 min,過(guò)濾,用少量蒸餾水洗殘?jiān)?。氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)用凱氏定氮儀進(jìn)行分析。氮溶指數(shù)表示溶解性。

    其中,W為穩(wěn)定性,%;W1為處理后的氮質(zhì)量分?jǐn)?shù);W0為處理前的氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

    7)起泡性及起泡穩(wěn)定性:參考曾慶祝[23]的方法,取5 mL 20 mg/mL樣品溶液于100 mL離心管中,20 000 r/min勻漿90 s后記泡沫體積V1;室溫放置30 min記泡沫體積V2。

    8)乳化性及乳化穩(wěn)定性:參考于泓鵬[24]的方法,取20 mL 60 mg/mL樣品溶液調(diào) pH 7.0,加入20 mL精制大豆油混合后8 000 r/min均質(zhì)2 min,等量分成2份分別倒進(jìn)離心管和試管中。將離心管中的乳濁液在1 500 g下離心5 min,記錄離心后乳化層體積V1和總體積V0。試管中的乳濁液于80℃保溫15 min,取出冷卻至室溫后1 500 g離心5 min記錄乳化層體積V2。

    1.3.7 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3組數(shù)據(jù)平均值,采用Excel 2007和Design Expert 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 酶篩選試驗(yàn)

    不同蛋白酶對(duì)牦牛骨的酶解效果見(jiàn)圖1。由圖1可知胃蛋白酶的水解度最高,依次是胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶,木瓜蛋白酶最低。水解度高的原因可能是酸性環(huán)境有利于鈣的溶出,使水解加深,也加大羥基磷灰石與溶液的接觸面積從而增加鈣的溶出造成雙向促進(jìn)[22]。但是胃蛋白酶解液中可溶性多肽的得率不高,可能是水解較為徹底,溶液中氨基酸得率較高而多肽得率并不高。堿性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶的可溶性多肽得率都較高,其中堿性蛋白酶最高,為18.13%。堿性蛋白酶酶活高,商業(yè)成本低,并且能夠得到盡可能多的可溶性多肽,綜合考慮,試驗(yàn)選取堿性蛋白酶作為試驗(yàn)最適酶制劑。

    圖1 各蛋白酶水解效果比較Fig.1 Hydrolysis effects of different kinds of enzymes

    2.2 最適酶單因素試驗(yàn)

    2.2.1 底物質(zhì)量濃度對(duì)酶解效果的影響 在酶底比6 000 U/g,酶解溫度55℃,酶解pH 8.5的條件下酶解5 h,考察底物對(duì)酶解效果的影響,結(jié)果如圖2所示,酶解液水解度隨酶底比的增加呈上升趨勢(shì),在3%以后上升較緩,5%時(shí)達(dá)到最大值后隨底物質(zhì)量濃度增大水解度減小。多肽得率隨底物質(zhì)量濃度的增加呈減小趨勢(shì),在4%后逐漸趨于平衡。底物質(zhì)量濃度呈一定比例增加,溶液中的可溶性多肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)增多,但其增加的比例小于底物增加的比例,這可能是導(dǎo)致得率逐漸減少的主要原因,而底物質(zhì)量濃度過(guò)低降低試驗(yàn)效率,增加成本,綜合考慮,底物質(zhì)量濃度范圍選取3~5 g/dL。

    2.2.2 酶底比對(duì)酶解效果的影響 在底物質(zhì)量濃度6 g/dL,酶解溫度55℃,酶解pH 8.5的條件下酶解5 h,考察酶底比對(duì)酶解效果的影響,結(jié)果如圖3所示,水解度和多肽得率都隨酶底比增加呈先增大后減小的趨勢(shì),水解度在6 000 U/g時(shí)達(dá)到最大為29.94%,多肽得率在4 000 U/g處達(dá)到最大值15.26%后緩慢下降。反應(yīng)初始階段,增加酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù),使酶和底物充分反應(yīng),水解度和可溶性多肽得率增大,而當(dāng)酶增加到與底物反應(yīng)達(dá)到飽和時(shí),再增大加酶量并不會(huì)促進(jìn)蛋白的水解,造成酶的浪費(fèi),因此,酶底比范圍選取4 000~8 000 U/g較為合適。

    圖2 底物質(zhì)量濃度對(duì)酶解效果的影響Fig.2 Influence of substrate content on hydrolysis

    圖3 酶底比對(duì)酶解效果的影響Fig.3 Influence of enzyme/substrate on hydrolysis

    2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響 在底物質(zhì)量濃度6 g/dL,溫度55℃,pH 8.5,酶底比6 000 U/g的條件下考察酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響,結(jié)果如圖4所示,在3 h時(shí),兩者已經(jīng)處于較大值,后隨時(shí)間的增加,二者都先上升后逐漸趨于平衡,最后水解度穩(wěn)定在26%左右,可溶性多肽得率在4 h時(shí)達(dá)到最大14.37%。在酶解的初始階段,酶解反應(yīng)劇烈,水解度增大,可溶性多肽得率也增大,隨著水解的進(jìn)行,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水解為多肽的速度小于多肽水解為氨基酸的速度時(shí),多肽得率就會(huì)緩慢下降,最后當(dāng)酶促反應(yīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡水解度和多肽含量也趨于平衡。所以,酶解時(shí)間選取3~5 h。

    圖4 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響Fig.4 Influence of time on hydrolysis

    2.2.4 酶解pH對(duì)酶解效果的影響 在底物質(zhì)量濃度6 g/dL,酶解溫度55℃,酶底比6 000 U/g的條件下酶解5 h,考察酶解pH對(duì)酶解效果的影響結(jié)果如圖5所示,水解度和多肽得率隨pH的增大變化不明顯,最高值分別為24.36%和13.61%。環(huán)境pH會(huì)影響酶分子的構(gòu)象和酶及底物的解離狀態(tài),酶活性部位只有在酶蛋白保持一定的空間構(gòu)象時(shí)才能體現(xiàn)出最大的催化功能,以此影響酶活性和酶促反應(yīng)速度,從結(jié)果看來(lái)堿性蛋白酶在試驗(yàn)pH環(huán)境下均能較好的催化水解反應(yīng),而過(guò)高的pH對(duì)設(shè)備存在一定的腐蝕性也會(huì)引入較多的雜離子,所以pH范圍考慮 7~9。

    圖5 酶解pH對(duì)酶解效果的影響Fig.5 Influence of pH on hydrolysis

    2.2.5 酶解溫度對(duì)酶解效果的影響 在底物質(zhì)量濃度6 g/dL,酶解pH 8.5,酶底比6 000 U/g的條件下酶解5 h,考察酶解溫度對(duì)酶解效果的影響結(jié)果如圖6所示水解度在50℃、多肽得率在45℃時(shí)達(dá)到最大值,分別為26.38%、16.62%。二者隨溫度升高變化不明顯,不同水浴環(huán)境下并不能完全控制溫度的差異值,考慮到實(shí)驗(yàn)環(huán)境的具體影響,選取酶解溫度為50℃。

    圖6 酶解溫度對(duì)酶解效果的影響Fig.6 Influence of temperature on hydrolysis

    從以上結(jié)果可以看出,底物質(zhì)量濃度對(duì)水解度和多肽得率的影響是顯著的,其次是酶底比和酶解時(shí)間,酶解溫度與pH最不明顯,而當(dāng)水解度處于最大值時(shí),多肽得率并非最高,二者不呈明顯的線性關(guān)系。水解度越高,水解越徹底,蛋白質(zhì)水解得到的多肽可能被進(jìn)一步水解為氨基酸,導(dǎo)致得率降低,所以在響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)時(shí)選取多肽得率為主要指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

    2.3 最適酶響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

    2.3.1 響應(yīng)面模型建立與方差分析 采用Design Expert 8.0軟件按照表2的編碼水平共設(shè)計(jì)29組試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表4。

    表4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results for response surface analysis

    采用Design Expert 8.0軟件對(duì)表4所示的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合和顯著性檢驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表5。以多肽得率為Y值,得到回歸方程Y=19.43-1.56A-1.14B-0.34C+1.38D+0.07AB+0.84AC-0.45AD+1.12BC+1.85BD+0.13CD-2.29A2-0.37B2+0.38C2-0.74D2。對(duì)回歸方程進(jìn)行失擬性檢驗(yàn)得F=0.86,P=0.616 5>P=0.05差異不顯著。對(duì)回其進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),F(xiàn)=27.95,P<0.000 1,極顯著。 相關(guān)系數(shù) R2=0.965 5,R2adj=0.930 9說(shuō)明回歸方程與實(shí)際情況擬合較好,使用該模型進(jìn)行分析是可靠的。從表5還可以看出, 模型中,A、B、D、AC、BC、BD、A2、D2對(duì)得率影響顯著,其中 A(底物質(zhì)量濃度)、B(酶底比)、D(酶解時(shí)間)、BD(酶底比和酶解時(shí)間的交互作用)極顯著。各因素影響順序?yàn)椋旱孜镔|(zhì)量濃度>酶解時(shí)間>酶底比>pH。

    表5 試驗(yàn)結(jié)果及方差分析Table 5 Variance analysis for fitted regression model

    2.3.2 因素間交互影響 從表5可看出AC、BC、BD之間的交互作用對(duì)多肽得率的影響是顯著的,由方程模型所做的響應(yīng)面曲面圖見(jiàn)圖7~9。如圖7~9所示,響應(yīng)值對(duì)底物質(zhì)量濃度的變化最敏感,表現(xiàn)為曲面較陡,其次是酶解時(shí)間和酶底比的相互影響,隨兩者的增大,底物和酶接觸得更充分,水解更徹底,生成的肽被進(jìn)一步水解可能是多肽得率減小的主要原因。響應(yīng)值對(duì)酶底比和pH的相互作用變化較不明顯,與表5的結(jié)果一致。

    2.3.3 響應(yīng)面模型驗(yàn)證試驗(yàn) 由回歸方程預(yù)測(cè)得到最佳酶解條件是底物質(zhì)量濃度3.49 g/dL,酶底比4 000 U/g,pH 7.0,酶解時(shí)間 3.75 h,此時(shí)多肽得率為22.74%,為方便驗(yàn)證,將參數(shù)修正為底物質(zhì)量濃度 3.5 g/dL,酶底比 4 000 U/g,pH 7.0,酶解時(shí)間4 h,此條件下制備的牦牛骨多肽得率為22.06%,接近于理論值,回歸方程可用于實(shí)踐。

    圖7 底物質(zhì)量濃度與pH交互影響多肽得率的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Effects of substrate content,pH on polypeptide yield

    圖8 時(shí)間與酶底比交互影響多肽得率的響應(yīng)曲面圖Fig.8 Effects of timeand enzyme/substrate on polypeptide yield

    圖9 pH與酶底比交互影響多肽得率的響應(yīng)曲面圖Fig.9 Effects of pH and enzyme/substrate on polypeptide yield

    2.4 酶解產(chǎn)物加工功能特性測(cè)定

    牦牛骨酶解產(chǎn)物的加工功能特性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

    表6 牦牛骨酶解產(chǎn)物加工功能特性Table 6 Processing functional properties of Yak hy drolysates

    從表6可以看出,牦牛骨的酶解產(chǎn)物具有良好的溶解性、穩(wěn)定性和起泡性,但是起泡穩(wěn)定性較差,靜置30 min后的泡沫體積明顯減少,乳化性和乳化穩(wěn)定性一般,乳化性與肽鏈長(zhǎng)短有關(guān),為了提高多肽的得率,試驗(yàn)所制備的酶解液的肽鏈較短,而要獲得良好的乳化性則需要120個(gè)氨基酸殘基[25],推測(cè)是乳化性一般的主要原因。結(jié)果與Li&Fan[26]略有差異,可能與酶解原料和產(chǎn)物純度有關(guān)。

    3 結(jié) 語(yǔ)

    堿性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶等不同酶種對(duì)酶解液多肽得率和水解度的影響表明試驗(yàn)最適用酶為堿性蛋白酶。單因素實(shí)驗(yàn)考察了底物質(zhì)量濃度、酶底比、酶解時(shí)間、pH、酶解溫度這5個(gè)因素對(duì)酶解液水解度和多肽得率的影響,結(jié)合Box-Behnken模型響應(yīng)面法優(yōu)化牦牛骨多肽制備工藝,得到最佳酶解條件為底物質(zhì)量濃度 3.5 g/dL,酶底比 4 000 U/g,pH 7.0,酶解時(shí)間4 h,此時(shí)多肽得率為22.06%。對(duì)酶解液加工功能測(cè)定,表明其溶解性、穩(wěn)定性、起泡性良好,分別是81%、58.9%、92.4%,乳化性和乳化穩(wěn)定性分別為24.33%、33.7%,為牦牛骨多肽在食品加工中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    猜你喜歡
    物質(zhì)量多肽牦牛
    美仁大草原的牦牛(外一章)
    跟著牦牛去巡山
    水庫(kù)工程區(qū)水土保持生態(tài)服務(wù)價(jià)值估算
    人民黃河(2020年12期)2020-12-30 12:55:30
    施肥量對(duì)谷子干物質(zhì)量積累及分配的影響
    不同播期與品種對(duì)糯玉米干物質(zhì)積累的影響
    高多肽含量苦瓜新品種“多肽3號(hào)”的選育
    一種柱狀金屬物質(zhì)量檢測(cè)器的研究
    電子制作(2017年10期)2017-04-18 07:23:14
    抗HPV18 E6多肽單克隆抗體的制備及鑒定
    目前牦??谔阋叩脑\斷與防治
    胎盤(pán)多肽超劑量應(yīng)用致嚴(yán)重不良事件1例
    亚洲丝袜综合中文字幕| 一进一出抽搐gif免费好疼| 别揉我奶头 嗯啊视频| 青春草国产在线视频 | 日韩视频在线欧美| 久久人妻av系列| 久久久久久久久久久丰满| 欧美丝袜亚洲另类| 99久国产av精品国产电影| 1024手机看黄色片| 国产成人影院久久av| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 99国产精品一区二区蜜桃av| 日本免费a在线| 国产视频首页在线观看| 我要搜黄色片| 欧美激情在线99| 亚洲欧美清纯卡通| 精品欧美国产一区二区三| 中国美女看黄片| 男人和女人高潮做爰伦理| 可以在线观看的亚洲视频| 韩国av在线不卡| 日本黄色片子视频| 桃色一区二区三区在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲图色成人| 男女那种视频在线观看| 国产探花在线观看一区二区| kizo精华| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 亚洲丝袜综合中文字幕| 99热精品在线国产| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 在线播放国产精品三级| 老女人水多毛片| 久久久精品大字幕| 看黄色毛片网站| kizo精华| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产精品乱码一区二三区的特点| 欧美激情国产日韩精品一区| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产精品乱码一区二三区的特点| 全区人妻精品视频| 黄色配什么色好看| 黄色配什么色好看| 久久久久国产网址| 成人永久免费在线观看视频| 天天一区二区日本电影三级| 国内精品一区二区在线观看| 精品不卡国产一区二区三区| av.在线天堂| 中文字幕av成人在线电影| 精品人妻视频免费看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 97超视频在线观看视频| 国产视频首页在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲无线在线观看| 一个人免费在线观看电影| 一区二区三区免费毛片| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 美女高潮的动态| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 在线免费观看的www视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 1024手机看黄色片| 色视频www国产| 日本三级黄在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 久久这里有精品视频免费| av在线亚洲专区| 日本成人三级电影网站| av.在线天堂| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产一区亚洲一区在线观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产精品久久久久久av不卡| 久久久久网色| 又爽又黄无遮挡网站| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 九草在线视频观看| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 美女国产视频在线观看| 国产视频首页在线观看| 精品久久久久久久末码| 亚洲人与动物交配视频| 成人二区视频| 亚洲三级黄色毛片| 伦精品一区二区三区| av在线蜜桃| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 哪里可以看免费的av片| 免费观看人在逋| 一级毛片我不卡| 日本黄色片子视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 在线天堂最新版资源| 日韩一本色道免费dvd| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚州av有码| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 中文在线观看免费www的网站| kizo精华| 黄色日韩在线| 三级国产精品欧美在线观看| 免费观看a级毛片全部| 丰满的人妻完整版| 哪里可以看免费的av片| 99久久无色码亚洲精品果冻| 99在线视频只有这里精品首页| 成年av动漫网址| 日韩在线高清观看一区二区三区| 欧美区成人在线视频| 日本与韩国留学比较| 亚洲综合色惰| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 久久九九热精品免费| 免费看av在线观看网站| 成人欧美大片| 日本成人三级电影网站| 91av网一区二区| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 午夜亚洲福利在线播放| 国产人妻一区二区三区在| 中文字幕免费在线视频6| 国产精品不卡视频一区二区| 两个人的视频大全免费| 看非洲黑人一级黄片| 中国国产av一级| 熟女人妻精品中文字幕| 丝袜喷水一区| 黄色日韩在线| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 日本黄大片高清| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产成人91sexporn| 亚洲av一区综合| 亚洲国产精品成人久久小说 | 成人永久免费在线观看视频| 成年女人看的毛片在线观看| 久久久成人免费电影| 成人漫画全彩无遮挡| 一本久久中文字幕| 晚上一个人看的免费电影| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产成人a区在线观看| 丝袜美腿在线中文| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久久久久久亚洲中文字幕| 一级二级三级毛片免费看| 国产高清不卡午夜福利| 禁无遮挡网站| 51国产日韩欧美| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品人妻久久久久久| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 一区二区三区免费毛片| 美女高潮的动态| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| av在线亚洲专区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产不卡一卡二| 一级二级三级毛片免费看| 欧美色视频一区免费| 老师上课跳d突然被开到最大视频| www.av在线官网国产| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲av成人av| av卡一久久| 中出人妻视频一区二区| 欧美日本视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 色吧在线观看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产精品一区二区性色av| 97超视频在线观看视频| 一区二区三区免费毛片| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲中文字幕日韩| 国产伦精品一区二区三区视频9| 嫩草影院新地址| 国产一级毛片在线| 免费av观看视频| 午夜福利高清视频| 波多野结衣高清作品| 男人的好看免费观看在线视频| 亚洲人成网站在线播| 欧美+日韩+精品| 日日啪夜夜撸| 久久精品综合一区二区三区| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 禁无遮挡网站| 国产乱人偷精品视频| 国产精品国产高清国产av| 精品人妻视频免费看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 欧美最黄视频在线播放免费| 天堂中文最新版在线下载 | 看非洲黑人一级黄片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产中年淑女户外野战色| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 我的老师免费观看完整版| 精品午夜福利在线看| 日韩欧美精品免费久久| 国产精品永久免费网站| 免费无遮挡裸体视频| 精华霜和精华液先用哪个| 嫩草影院精品99| 久久久国产成人免费| 国产日韩欧美在线精品| 高清午夜精品一区二区三区 | 九九爱精品视频在线观看| 亚洲性久久影院| 中文欧美无线码| 最近视频中文字幕2019在线8| 一进一出抽搐动态| 可以在线观看毛片的网站| 身体一侧抽搐| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产 一区 欧美 日韩| 国语自产精品视频在线第100页| 男女下面进入的视频免费午夜| 校园人妻丝袜中文字幕| 成人二区视频| 亚洲最大成人中文| 日韩中字成人| 国产视频首页在线观看| 国产真实乱freesex| 观看免费一级毛片| 女同久久另类99精品国产91| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 天天躁日日操中文字幕| 欧美高清性xxxxhd video| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 午夜福利在线观看吧| 亚洲天堂国产精品一区在线| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲av男天堂| 成人无遮挡网站| 欧美高清性xxxxhd video| 国产老妇女一区| 97超视频在线观看视频| 毛片女人毛片| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲av男天堂| 亚洲va在线va天堂va国产| 级片在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲精品色激情综合| 久久久久网色| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美区成人在线视频| 草草在线视频免费看| 毛片一级片免费看久久久久| 久久人妻av系列| 精品人妻偷拍中文字幕| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产黄a三级三级三级人| 成人鲁丝片一二三区免费| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲自偷自拍三级| 美女 人体艺术 gogo| 欧美人与善性xxx| 我的女老师完整版在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲无线观看免费| 草草在线视频免费看| 97热精品久久久久久| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲精品日韩av片在线观看| 成人无遮挡网站| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲va在线va天堂va国产| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 日韩中字成人| 99热全是精品| 亚洲av中文av极速乱| 麻豆成人午夜福利视频| 看十八女毛片水多多多| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 麻豆成人av视频| 欧美性猛交黑人性爽| 日韩大尺度精品在线看网址| 五月玫瑰六月丁香| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 99热网站在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 久久精品国产自在天天线| 久久久国产成人精品二区| 波多野结衣高清无吗| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲电影在线观看av| 性插视频无遮挡在线免费观看| 看免费成人av毛片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 内射极品少妇av片p| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 日韩成人伦理影院| 亚洲无线在线观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 久久精品综合一区二区三区| 18+在线观看网站| 亚洲欧洲日产国产| 久久久欧美国产精品| 欧美一区二区国产精品久久精品| 亚洲人成网站在线观看播放| 我要看日韩黄色一级片| 久久久久久久久久成人| 一区二区三区四区激情视频 | 亚洲欧美精品专区久久| 一区福利在线观看| 国产成人aa在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 久久精品久久久久久久性| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 中国美女看黄片| 国产午夜精品一二区理论片| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲不卡免费看| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲美女搞黄在线观看| 久久亚洲精品不卡| 亚洲第一电影网av| 丰满的人妻完整版| 久久人妻av系列| 免费电影在线观看免费观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲综合色惰| 十八禁国产超污无遮挡网站| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产av麻豆久久久久久久| 变态另类丝袜制服| av在线老鸭窝| 国产成人精品婷婷| 精品久久久久久久久久免费视频| 天堂√8在线中文| 久久久精品大字幕| 国产成人精品婷婷| 看黄色毛片网站| 中文字幕熟女人妻在线| 中文资源天堂在线| av在线播放精品| 黄色配什么色好看| 日韩av在线大香蕉| 波野结衣二区三区在线| 久久午夜福利片| 免费av不卡在线播放| videossex国产| 亚洲中文字幕日韩| 欧美色视频一区免费| 麻豆久久精品国产亚洲av| 在线免费十八禁| 小说图片视频综合网站| 国产成人影院久久av| 中文亚洲av片在线观看爽| 好男人视频免费观看在线| 九草在线视频观看| 成人无遮挡网站| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲av免费高清在线观看| 永久网站在线| 1024手机看黄色片| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | www日本黄色视频网| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 一级黄色大片毛片| 久久久色成人| 亚洲精品亚洲一区二区| 婷婷色av中文字幕| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 91精品一卡2卡3卡4卡| 夜夜夜夜夜久久久久| 22中文网久久字幕| 欧美色欧美亚洲另类二区| 深夜a级毛片| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 天美传媒精品一区二区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲成人久久性| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 激情 狠狠 欧美| 尾随美女入室| 丝袜美腿在线中文| 免费观看在线日韩| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 综合色丁香网| 三级经典国产精品| 精品久久久久久久末码| 黄色配什么色好看| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 久久久久久国产a免费观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 午夜福利视频1000在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲内射少妇av| 午夜久久久久精精品| 久久国产乱子免费精品| 国产真实乱freesex| 欧美日韩综合久久久久久| 国产黄色小视频在线观看| 97超碰精品成人国产| 亚洲精品色激情综合| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲国产精品国产精品| av国产免费在线观看| 一级黄片播放器| 天堂中文最新版在线下载 | 99热这里只有是精品50| 国产黄a三级三级三级人| 尾随美女入室| videossex国产| 亚洲精品自拍成人| 一边亲一边摸免费视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 少妇人妻一区二区三区视频| 久久久久网色| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 99久久无色码亚洲精品果冻| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 国产 一区 欧美 日韩| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产久久久一区二区三区| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产乱人偷精品视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 欧美高清性xxxxhd video| 一区福利在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 最好的美女福利视频网| 久久人人爽人人片av| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲人与动物交配视频| 国产精品一二三区在线看| 麻豆成人av视频| 舔av片在线| 日韩欧美在线乱码| 一级二级三级毛片免费看| 精品人妻熟女av久视频| 午夜福利高清视频| 51国产日韩欧美| 波多野结衣高清无吗| 热99re8久久精品国产| 精品人妻偷拍中文字幕| 最近2019中文字幕mv第一页| 中文字幕av成人在线电影| 国模一区二区三区四区视频| 日本成人三级电影网站| 嫩草影院入口| 女同久久另类99精品国产91| 一区二区三区免费毛片| 国产精品一区二区在线观看99 | 免费黄网站久久成人精品| 村上凉子中文字幕在线| 欧美xxxx性猛交bbbb| 成人毛片60女人毛片免费| 久久午夜亚洲精品久久| av.在线天堂| 国产精品久久视频播放| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 久久鲁丝午夜福利片| 狠狠狠狠99中文字幕| 天天一区二区日本电影三级| 嫩草影院新地址| 日本熟妇午夜| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 岛国毛片在线播放| 色播亚洲综合网| 亚洲av二区三区四区| 天天躁日日操中文字幕| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 99riav亚洲国产免费| 亚洲中文字幕日韩| 国内精品宾馆在线| 91久久精品电影网| 国产中年淑女户外野战色| av天堂在线播放| 欧美3d第一页| 免费观看a级毛片全部| 免费黄网站久久成人精品| 婷婷六月久久综合丁香| 久久人妻av系列| 99久久精品热视频| 黄色视频,在线免费观看| 午夜激情欧美在线| 哪个播放器可以免费观看大片| 久久精品国产亚洲av天美| 久久亚洲精品不卡| 亚洲国产精品国产精品| 在线免费观看的www视频| 国内精品久久久久精免费| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲欧美日韩东京热| 一边摸一边抽搐一进一小说| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久精品夜色国产| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久草成人影院| 国产不卡一卡二| 国产av一区在线观看免费| 免费电影在线观看免费观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 在线免费观看的www视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 久久久精品94久久精品| 久久久久免费精品人妻一区二区| 69人妻影院| 一个人看的www免费观看视频| 在线观看午夜福利视频| 99视频精品全部免费 在线| 久久国内精品自在自线图片| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 亚洲精品国产av成人精品| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 在线免费观看不下载黄p国产| 最好的美女福利视频网| 成熟少妇高潮喷水视频| www.色视频.com| 午夜精品一区二区三区免费看| 97在线视频观看| 国产成人一区二区在线| 岛国在线免费视频观看| 一级黄色大片毛片| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲精品自拍成人| 久久草成人影院| 免费av毛片视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 久久久久久大精品| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产精品久久久久久av不卡| 国产一级毛片七仙女欲春2| 欧美色视频一区免费| 日日啪夜夜撸| 午夜精品国产一区二区电影 | 成年女人永久免费观看视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 日韩av在线大香蕉| 在线天堂最新版资源| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国语自产精品视频在线第100页| 97热精品久久久久久| 国产高清不卡午夜福利| 好男人在线观看高清免费视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久草成人影院| 丰满的人妻完整版| av专区在线播放| 国内精品美女久久久久久| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 成人一区二区视频在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美区成人在线视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 一个人看视频在线观看www免费| 久久6这里有精品| 人妻夜夜爽99麻豆av| 性欧美人与动物交配| 高清日韩中文字幕在线| 人人妻人人看人人澡| 69av精品久久久久久| 人体艺术视频欧美日本| 久久久国产成人免费| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲第一电影网av| 久久久久久大精品|