礦物質(zhì)復(fù)合微量元素對乳酸菌生長及生物學(xué)特征的影響

孔 潔， 張 涵， 李亭玉， 李艷茹， 張 敏， 李太元

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

礦物質(zhì)是地殼中自然存在的天然元素。土壤礦物質(zhì)是由地殼的礦物巖石經(jīng)過風(fēng)化而形成的土壤中大小不同的礦物質(zhì)顆粒[1]。來自地質(zhì)體的地球化學(xué)元素通過巖石→土壤→生物垂直系統(tǒng)的運營、轉(zhuǎn)化、富集，是影響生物的生理生化過程、營養(yǎng)價值及有機組分含量特別是礦物質(zhì)含量的重要因素，導(dǎo)致不同地區(qū)、不同種類的植物中礦物質(zhì)含量的差異[2]。土壤礦物質(zhì)(如高嶺土、針鐵礦等)是土壤的重要組成成分，它們對土壤自身有機質(zhì)的吸附保護作用可以提高其自身有機質(zhì)的穩(wěn)定性[3]。微量元素含量的相關(guān)性可能取決于生態(tài)環(huán)境、元素在植物體內(nèi)的分布以及運轉(zhuǎn)狀況等原因，導(dǎo)致微量元素本身之間協(xié)同或拮抗作用的原因復(fù)雜，有待于進一步研究[4]。

乳酸菌(lacticacidbacteria，LAB)是一類能發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性、不產(chǎn)芽孢的微生物，是益生菌中最具代表性的菌屬[5]。乳酸菌作為一種優(yōu)良益生菌，在動物腸道內(nèi)發(fā)揮有效的生理功能，調(diào)節(jié)腸道內(nèi)正常菌群的平衡，參與多種維生素的合成。乳酸菌發(fā)酵過程中的抑菌代謝產(chǎn)物包括有機酸和細(xì)菌素，乳酸菌細(xì)菌素作為一類生物抑菌劑近年來得到了廣泛關(guān)注[6]。本試驗采用礦物粉作為試驗材料，研究礦物粉對保加利亞乳桿菌、李糖鼠乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌等4種受試菌種的生長及生物學(xué)特性，對進一步開發(fā)利用礦物粉資源和乳酸菌生長提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1) 菌種 保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricuscode：1.1480)；李糖鼠乳桿菌(Lactobacillusrhamnosuscode：1.1046)；乳酸乳球菌(Lactococcuslactiscode：1.2470)嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophiluscode：1.1854)。試驗菌種均購自中國科學(xué)院微生物研究所。

2) 藥品與試劑 礦物質(zhì)復(fù)合微量元素制劑(由天然礦物調(diào)制而制成的復(fù)合微量元素制劑)；K粉(由微生物實驗室提供)；MRS肉湯(營養(yǎng)肉湯)；瓊脂粉；均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備

試驗菌種以劃線法接種于MRS瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h[7]。用接種環(huán)挑取平板中3～5個菌落，接種在MRS液體試管中，于37 ℃厭氧培養(yǎng)18～24 h，使其OD值分布在0.7±0.1之間，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 K粉對乳酸菌增殖的影響

在MRS液體培養(yǎng)基中添加K粉，制備含K粉濃度梯度液體培養(yǎng)基。設(shè)置K粉濃度梯度分別為0，0.1%，0.2%～0.9%，1%，2%～10%，于121 ℃，15 min高壓滅菌備用。取乳酸菌菌懸液100 μL，分別接種到MRS液體梯度試管中混勻，置37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)48 h。

培養(yǎng)菌液采用平板計數(shù)法計細(xì)菌數(shù)，重復(fù)3次，取平均值，分析K粉對乳酸菌增殖的最適作用濃度。

1.2.3 K粉對乳酸菌酸堿耐受性的影響

制備含有最適濃度K粉(1.2.2)的MRS液體培養(yǎng)基試管(標(biāo)記為K-乳酸菌，下同)和空白MRS液體培養(yǎng)基試管(標(biāo)記為P-乳酸菌，下同)，分別用1 mol/L HCL和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH梯度，使用pH酸度儀調(diào)整pH梯度分別為2、4、6、7、9、10，取乳酸菌菌懸液100 μL，分別接種到MRS液體試管中混勻，置37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)菌液采用平板計數(shù)法計細(xì)菌數(shù)，重復(fù)3次，取平均值，分析K粉對乳酸菌酸堿耐受性的影響。

1.2.4 K粉對乳酸菌溫度耐受性的影響

制備含有最適濃度K粉的MRS液體培養(yǎng)基試管和空白MRS液體培養(yǎng)基試管，取乳酸菌菌懸液100 μL，分別接種到MRS液體試管中混勻，將試驗組試管分別置于40、60和80 ℃中水浴加熱10，20，30 min處理，37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)菌液采用平板計數(shù)法計細(xì)菌數(shù)，重復(fù)3次，取平均值，分析K粉對乳酸菌溫度耐受性的影響。

1.2.5 K粉對乳酸菌生長曲線的影響

制備含有最適濃度K粉的MRS液體培養(yǎng)基試管和空白MRS液體培養(yǎng)基試管，取乳酸菌菌懸液100 μL，分別接種到MRS液體試管中混勻，置37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)48 h，每3 h取1次菌液，共計16次。培養(yǎng)菌液采用平板計數(shù)法計細(xì)菌數(shù)，重復(fù)3次，取平均值，分析K粉對乳酸菌生長曲線的影響。

1.2.6 K粉對乳酸菌抑菌效果的影響

制備含有最適濃度K粉的MRS液體培養(yǎng)基試管和空白MRS液體培養(yǎng)基試管，取乳酸菌菌懸液100 μL，分別接種到MRS液體試管中混勻，37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)。將上述培養(yǎng)的乳酸菌菌液取出，以10 000 r/min離心2 min，取上清液用2.2 μm濾菌膜過濾，即為乳酸菌代謝產(chǎn)物[8]。將藥敏片浸泡于乳酸菌代謝產(chǎn)物中，浸泡30 min即可。制作0.5號麥?zhǔn)蠞岫萚9]的大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，沙門氏菌的菌懸液(或經(jīng)比濁法和活菌計數(shù)法測定，配制成1×106cfu/mL菌液[10])，采用K-B法[11]，37 ℃條件下培養(yǎng)24、48 h后，測試4種乳酸菌代謝產(chǎn)物對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，沙門氏菌的抑菌效果，重復(fù)3次，分別測抑菌圈直徑，取平均值，分析K粉對乳酸菌代謝產(chǎn)物抑菌效果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 K粉濃度對乳酸菌增殖的影響

由圖1可知，與空白組(即0 g/mL)相比，K粉對乳酸菌的生長均有促進作用，隨著K粉濃度的增加，乳酸菌的數(shù)量不斷增加，當(dāng)K粉濃度分別達到0.1、0.25、0.25和0.5 g/mL時，保加利亞乳桿菌、李糖鼠乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌的細(xì)菌數(shù)達到峰值，隨著K粉濃度不斷提高，乳酸菌的數(shù)量逐漸緩慢下降。

圖1 K粉濃度對乳酸菌的影響Fig.1 Effect of K powder concentration on lactic acid bacteria

2.2 K粉對乳酸菌耐酸堿作用的影響

由圖2可知，與空白組相比，K粉增強了保加利亞乳桿菌、李糖鼠乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌的酸堿耐受能力，當(dāng)pH值為4時，K粉對李糖鼠乳桿菌、嗜酸乳桿菌的酸堿作用最強；當(dāng)pH值為9時，K粉對保加利亞乳桿菌的耐堿能力最大。

圖2 K粉對乳酸菌酸堿耐受能力的影響Fig.2 Effect of K powder on acid and alkali tolerance of lactic acid bacteria

2.3 K粉對乳酸菌溫度耐受性的影響

由圖3～6可知，乳酸菌經(jīng)40 ℃熱處理后，對其菌體生產(chǎn)基本不產(chǎn)生影響；乳酸菌經(jīng)60 ℃ 10 min熱處理后，K粉對保加利亞乳桿菌的溫度耐受能力大于空白對照組；但經(jīng)60和80 ℃熱處理后，添加K粉后嗜酸乳桿菌的細(xì)菌數(shù)與空白對照組細(xì)菌數(shù)無明顯變化。與空白組相比，K粉對保加利亞乳桿菌、李糖鼠乳桿菌、乳酸乳球菌的溫度耐受能力有一定的提高，但高溫處理后，對嗜酸乳桿菌的溫度耐受能力無明顯作用。

圖3 K粉對保加利亞乳桿菌溫度耐受能力的影響Fig.3 Effect of K powder on temperaturetolerance of Lactobacillus bulgaricus

圖4 K粉對李糖鼠乳桿菌溫度耐受能力的影響Fig.4 Effect of K powder on temperaturetolerance of Lactobacillus rhamnosus

圖5 K粉對乳酸乳球菌溫度耐受能力的影響Fig.5 Effect of K powder on temperature tolerance of Lactococcus lactis

圖6 K粉對嗜酸乳桿菌溫度耐受能力的影響Fig.6 Effect of K powder on temperaturetolerance of Lactobacillus acidophilus

2.4 K粉對乳酸菌生長曲線的影響

由圖7可知，與空白組相比，K粉縮短了保加利亞乳桿菌的適應(yīng)期(由0～12 h至0～9 h)，提高了對數(shù)生長期的生長速度；延長了李糖鼠乳桿菌的對數(shù)生長期(由6～36 h至6～39 h)，提高了對數(shù)生長期的生長速度；縮短了乳酸乳球菌的適應(yīng)期(由0～9 h至0～6 h)，提高了對數(shù)生長期的生長速度；縮短了嗜酸乳桿菌的適應(yīng)期(由0～12 h至0～9 h)，提高了對數(shù)生長期的生長速度。

圖7 K粉對乳酸菌生長曲線的影響Fig.7 Effect of K powder on lactic acid bacteria growth curve

2.5 K粉對乳酸菌細(xì)菌素抑菌作用的影響

由圖8～11可知，乳酸菌培養(yǎng)24 h后，在最適K粉作用濃度下，乳酸菌代謝產(chǎn)物對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌作用均大于空白對照組；乳酸菌培養(yǎng)48 h后，乳酸乳球菌代謝產(chǎn)物對大腸桿菌、沙門氏菌無抑菌作用，李糖鼠乳桿菌代謝產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌無抑菌作用，在最適K粉作用濃度下，保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌代謝產(chǎn)物對3種細(xì)菌的抑菌作用均大于空白對照組。因此，乳酸菌培養(yǎng)24 h比培養(yǎng)48 h后所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物更多，且K粉提高了乳酸菌代謝產(chǎn)物對3種細(xì)菌的抑制作用。

圖8 K粉對保加利亞乳桿菌代謝產(chǎn)物抑菌作用的影響Fig.8 Effect of K powder on bacteriostaticability of Lactobacillus bulgaricus

圖9 K粉對李糖鼠乳桿菌代謝產(chǎn)物抑菌作用的影響Fig.9 Effect of K powder on bacteriostaticability of Lactobacillus rhamnosus

圖10 K粉對乳酸乳球菌代謝產(chǎn)物抑菌作用的影響Fig.10 Effect of K powder on bacteriostaticability of Lactococcus lactis

圖11 K粉對嗜酸乳桿菌代謝產(chǎn)物抑菌作用的影響Fig.11 Effect of K powder on bacteriostatic ability of Lactobacillus acidophilus

3 討論

在巖石→土壤→生物的生態(tài)系統(tǒng)中，土壤是維持礦物質(zhì)循環(huán)的基礎(chǔ)[12]，是維系生態(tài)系統(tǒng)里生命體的主要來源，礦物元素的缺乏和不足會影響到動植物元素水平的高低，礦物元素在土壤、微生物體內(nèi)存在一定的相關(guān)性。礦物粉為乳酸菌的生長除了提供基礎(chǔ)的常量元素外，還為乳酸菌的增殖生長提供了微量元素。本試驗設(shè)置不同礦物粉濃度的結(jié)果表明，當(dāng)K粉濃度分別達到0.1、0.25、0.25和0.5 g/mL時，保加利亞乳桿菌、李糖鼠乳桿菌、乳酸乳球菌和嗜酸乳桿菌的細(xì)菌總數(shù)達到峰值，礦物粉不僅促進乳酸菌生長繁殖，縮短乳酸菌的生長適應(yīng)期，同時能夠延長其對數(shù)生長期，提高菌體對數(shù)期的增長速度。

正常胃液pH值為1.5～2.0，胃液中的鹽酸可以殺死隨食物進入胃內(nèi)的細(xì)菌[13]，胃酸的分泌導(dǎo)致胃內(nèi)pH值呈酸性，過低的pH值影響乳酸菌的生長。此外，熊素玉等[14]發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液pH值的動態(tài)變化主要是由乳酸菌在生長過程中產(chǎn)生乳酸引起，乳酸的積累影響乳酸菌的生長，乳酸是一種解偶聯(lián)劑，起到使質(zhì)子從培養(yǎng)液中進入細(xì)胞的質(zhì)子泵作用，隨著乳酸的積累，胞外與胞內(nèi)的pH值均下降，進而抑制乳酸菌的生長。本試驗調(diào)節(jié)不同pH值梯度的結(jié)果表明，礦物粉可以提高乳酸菌的酸堿耐受能力，為乳酸菌培養(yǎng)過程中的耐酸堿度提供了一定的理論依據(jù)。

溫度是微生物生命活動中重要的環(huán)境因子，當(dāng)溫度改變時，微生物必須通過調(diào)節(jié)脂類的組成、胞內(nèi)酶的活性、蛋白質(zhì)的合成、基因調(diào)控和RNA的合成以適應(yīng)環(huán)境溫度的變化[15]。同時，環(huán)境溫度會影響活菌制劑的生產(chǎn)、運輸、保存及使用[16]。本試驗對乳酸菌分別設(shè)置3個溫度[17]的結(jié)果表明，礦物粉可以提高保加利亞乳桿菌、李糖鼠乳桿菌、乳酸乳球菌對溫度的耐受能力，但高溫處理后，對嗜酸乳桿菌的溫度耐受性無明顯變化。乳酸菌實際生產(chǎn)過程中，適宜的溫度可以縮短乳酸菌的凝乳時間，過高或過低的環(huán)境溫度都可導(dǎo)致菌體蛋白變形，菌體代謝發(fā)生改變，從而導(dǎo)致乳酸菌失活。

乳酸菌自身在代謝過程中能夠產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，這些物質(zhì)在細(xì)菌體內(nèi)的核糖體中合成具有抑菌活性的多肽類物質(zhì)，能夠?qū)Χ喾N細(xì)菌產(chǎn)生抑菌作用[18]。乳酸菌細(xì)菌素是細(xì)菌通過核糖體合成機制產(chǎn)生并分泌到環(huán)境中的一類對同種或親緣關(guān)系較近的一種有抑菌活性的低分子質(zhì)量的蛋白或多肽類物質(zhì)[19]。本試驗培養(yǎng)不同時間內(nèi)乳酸菌代謝產(chǎn)物的結(jié)果表明，礦物粉可以提高乳桿菌的代謝產(chǎn)物，其生理作用抑制大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的生長。乳酸菌在食品加工生產(chǎn)中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物(如乳酸及乳酸菌素)，不僅可以增加乳酸食品的味覺，同時還能夠抑制某些微生物的繁殖生長[20]。

4 結(jié)論

本試驗采用礦物粉作為材料進行試驗的結(jié)果表明，礦物粉可以促進保加利亞乳桿菌、李糖鼠乳桿菌、乳酸乳球菌和嗜酸乳桿菌的生長，其最適作用濃度分別為0.1、0.25、0.25、0.5 mg/mL。此外，礦物粉在一定程度上提高了乳酸菌對酸堿、溫度的耐受能力，其代謝產(chǎn)物對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均起到相對抑制的作用。礦物粉作為一種天然的復(fù)合材料，為乳酸菌培養(yǎng)過程中微量元素的添加提供了一定的理論基礎(chǔ)。