利用PicoGreen作為檢測(cè)探針建立基于核酸適配體識(shí)別的玉米赤霉烯酮快速檢測(cè)方法

金慶日， 苗靈燕， 田廣燕， 方維煥， 宋厚輝*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院;2.浙江農(nóng)林大學(xué)外國(guó)語(yǔ)學(xué)院：浙江 臨安 311300;3.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

食品安全問題是每個(gè)人日常生活中不可忽略的大問題，在全球各地已引起廣泛關(guān)注。如何快速有效鑒別食品中是否存在有毒成分已成為世界各國(guó)積極推進(jìn)的研究工作。根據(jù)有關(guān)調(diào)查顯示，真菌毒素是造成谷物糧食數(shù)量和質(zhì)量降低的元兇之一[1]。為有效控制此類事情的發(fā)生，針對(duì)存在于食品和農(nóng)作物中的真菌毒素進(jìn)行殘留監(jiān)控十分必要[2]，如何有效檢測(cè)真菌毒素已成為世界各國(guó)關(guān)注的焦點(diǎn)。

玉米赤霉烯酮(Zearalenone)簡(jiǎn)稱為ZEN。ZEN的主要侵染對(duì)象為玉米、小麥、燕麥和大米等農(nóng)作物。有研究表明，ZEN的陽(yáng)性檢出率在玉米中約為45%，在小麥中約為20%[3]。ZEN具有類似于雌激素的作用，它會(huì)使動(dòng)物出現(xiàn)慢性或急性中毒的癥狀，動(dòng)物血液中的雌激素水平也會(huì)顯著升高，從而導(dǎo)致中毒動(dòng)物的繁殖機(jī)能出現(xiàn)異常，出現(xiàn)頭暈、精神抑郁、共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀，嚴(yán)重時(shí)甚至出現(xiàn)死亡[4]，動(dòng)物中對(duì)ZEN最易感的是豬[5]。

當(dāng)前較為常用的ZEN檢測(cè)方法主要有薄層層析法(TLC)[6]、高效液相色譜法(HPLC)[7]、氣相色譜法(GC)[8]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC/MS/MS)[9]和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等[10]。但是這些方法具有檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度和特異性差、需要昂貴的儀器設(shè)備、大量有機(jī)溶劑以及需要通過凈化洗滌，衍生或濃縮等十分繁復(fù)的樣品預(yù)處理過程等缺點(diǎn)。而免疫學(xué)相關(guān)的檢測(cè)方法是近期新發(fā)展起來的一種檢測(cè)方法，主要方法有酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法、放射免疫性鑒定(RIA)法[11]和膠體金免疫層析試紙條(CGIA)法[12]等。但CGIA法的缺點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度不高，放射免疫分析法可能造成放射性污染，不適合在基層推廣應(yīng)用。雖然ELISA 法的特異性和靈敏度都較高，操作步驟簡(jiǎn)單，但是ZEN的 ELISA 檢測(cè)試劑盒價(jià)格昂貴。因此，急需建立一種價(jià)格低廉、靈敏準(zhǔn)確的ZEN快速檢測(cè)方法。

核酸適配體是一種單鏈DNA，是利用體外篩選技術(shù)-SELEX篩選富集進(jìn)化技術(shù)[13]，從DNA文庫(kù)中篩選與相應(yīng)的互補(bǔ)鏈發(fā)生特異性結(jié)合的DNA片段[14]。核酸適配體以其不同于抗體的檢測(cè)方法目前已廣泛應(yīng)用于各類生物樣品的檢測(cè)[15]。只需先設(shè)計(jì)出相應(yīng)的核酸序列，便可合成相應(yīng)適配體，較抗體具有使用方便、易修飾、無免疫原性、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等特點(diǎn)。目前關(guān)于核酸適配體的定量檢測(cè)方法主要有：熒光標(biāo)記法、膠體金法和磁珠法等[16]。

傳統(tǒng)的ELISA方法檢測(cè)ZEN雖具有較好的靈敏度與特異性，但抗體歸根結(jié)底是一種蛋白質(zhì)，容易在高溫、不適宜pH值等環(huán)境因素下發(fā)生變性，且抗體制備價(jià)格較高。而適配體是比蛋白質(zhì)小的DNA或RNA[17]，不同于蛋白質(zhì)的是經(jīng)指數(shù)富集后，核酸適配體所具有的靈敏度和特異性與抗原-抗體反應(yīng)相當(dāng)，且它更易合成，也不易受環(huán)境影響而變性。

本文選用已報(bào)道的ZEN特異性核酸適配體，利用非標(biāo)記熒光染料PicoGreen識(shí)別雙鏈DNA的特異性，建立了一種快速、高效檢測(cè)ZEN的方法，適用于尚缺高端檢測(cè)設(shè)備(如HPLC和LC/MS/MS)的基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)大批量樣品的快速篩查，具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ZEN、CTN、AFB1、OTA和FB1(美國(guó)Sigma 公司)；PicoGreen(Life Technologies公司)；氯化鈉(Sodium Chloride)、氯化鉀(Potassium Chloride)(西隴化工股份有限公司)；碳酸鈉(Sodium carbonate)、碳酸氫鈉(Sodium Bicarbonate)、吐溫-20(Tween-20)(life Sciences公司)；磷酸二氫鉀(potassium dihydrogen phosphate)、磷酸氫二鈉(Disodium hydrogen phosphate)(Sangon Biotech公司)；脫脂奶(skim milk)(碧迪醫(yī)療器械上海有限公司)；ZEN抗體和ZEN-OVA由本實(shí)驗(yàn)室制備。

小型高速離心機(jī)(Beckman Coulter公司，型號(hào)為Microfuge 16)；熒光檢測(cè)儀(BioTek公司，型號(hào)為SynergyTMH1)；超純水儀(Thermo Fisher Scientific公司，型號(hào)為D11921)；渦旋攪拌器(Scientific Industries公司)；數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機(jī)有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)；電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；恒溫金屬浴(浙江納德科學(xué)儀器有限公司)。

ZEN核酸適配體[18]、ZEN核酸適配體互補(bǔ)鏈[18]由蘇州金唯智生物科技有限公司合成(表1)。

表1 ZEN核酸適配體及互補(bǔ)鏈名稱與序列

1.2 檢測(cè)原理

PicoGreen是一種可以定量檢測(cè)雙鏈DNA的新型染料，且不與單鏈DNA結(jié)合，其靈敏度可達(dá)pg級(jí)，與雙鏈核酸結(jié)合以后產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度可以增加1000倍及以上[19]。當(dāng)ZEN存在時(shí)，核酸適配體與ZEN結(jié)合，空間構(gòu)象會(huì)發(fā)生一定的變化，而不能與互補(bǔ)鏈(seq1)形成雙鏈DNA，當(dāng)ZEN不存在時(shí)，核酸適配體則能夠雜交形成DNA雙鏈。而DNA雙鏈則可被PicoGreen結(jié)合從而激發(fā)熒光，可通過酶標(biāo)儀檢測(cè)其熒光信號(hào)強(qiáng)度，通過熒光信號(hào)的強(qiáng)弱檢測(cè)樣品中ZEN的濃度[20](圖1)。

圖1 ZEN檢測(cè)原理圖解[20]

1.3 PicoGreen與雙鏈DNA最佳反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

取50 μL核酸適配體溶液和50 μL互補(bǔ)鏈Seq1溶液于孔內(nèi)混勻(1∶1)，于25 ℃恒溫金屬浴反應(yīng)20 min，每孔再加入10 μL PicoGreen[20]混合均勻后迅速置于酶標(biāo)儀，連續(xù)檢測(cè)30 min的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)：480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：520 nm)，重復(fù)4次。

1.4 ZEN檢測(cè)的靈敏度試驗(yàn)

用緩沖溶液將ZEN分別稀釋成終濃度為0.1、0.2、0.4、0.5和1 μg/L的溶液。取50 μL ZEN溶液與25 μL 40 nmol/L ZEN核酸適配體于離心管中震蕩混勻，置于25 ℃恒溫金屬浴反應(yīng)20 min，加入25 μL 40 nmol/L的互補(bǔ)鏈溶液，于25 ℃恒溫金屬浴繼續(xù)反應(yīng)5 min，最后每孔加入10 μL PicoGreen，混合均勻后立即置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)其熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)：480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：520 nm)，重復(fù)4次。

1.5 Aptamer/PicoGreen ZEN檢測(cè)方法的建立

取50 μL樣品溶液與25 μL 10 nmol/L核酸適配體于離心管中震蕩混勻，在25 ℃恒溫金屬浴中反應(yīng)20 min，再加入25 μL 10 nmol/L適配體互補(bǔ)鏈溶液，震蕩混勻，于25 ℃恒溫金屬浴繼續(xù)反應(yīng)5 min，每孔中再加入10 μL PicoGreen，混勻攪拌，隨即置于熒光檢測(cè)儀中檢測(cè)其熒光強(qiáng)度(參數(shù)設(shè)置：激發(fā)波長(zhǎng)480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm)。

1.6 ZEN核酸適配體特異性試驗(yàn)

將ZEN、CTN、AFB1、OTA和FB1稀釋為1 μg/L，分別取50 μL各毒素溶液與25 μL 40 nmol/L ZEN核酸適配體溶液震蕩混勻，置于25 ℃恒溫金屬浴中反應(yīng)20 min，加入25 μL 40 nmol/L互補(bǔ)鏈溶液于25 ℃繼續(xù)反應(yīng)5 min，最后每孔加入10 μL PicoGreen，于孔內(nèi)混勻，隨即置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)其熒光強(qiáng)度 (參數(shù)設(shè)置：激發(fā)波長(zhǎng)480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm)。

1.7 與ELISA檢測(cè)法的一致性

牛奶用緩沖溶液稀釋成1%的溶液作為樣品。取28份樣品，分別加ZEN，使溶液的終濃度依次為1、2、2.5、5、10、50和 100 μg/L，每種濃度檢測(cè)4份樣品。另取10份牛奶樣品作為陰性對(duì)照。

100 μL OVA-ZEN(50 ng/mL)于微孔板上4 ℃包被過夜，PBST洗滌3次。加入200 μL 5%脫脂牛奶，室溫下(25 ℃)孵育2 h(300 r/min)，PBST洗滌3次。檢測(cè)樣品溶液時(shí)，每孔加入100 μL樣品混合液(ZEN-Ab溶解于樣品溶液，體積比為1∶50 000)。室溫下(25 ℃)孵育1 h(300 r/min)，每孔加入二抗100 μL，于室溫(25 ℃)下孵育1 h(300 r/min)，PBST洗滌3次。每孔加入100 μL TMB顯色液，吹打混勻，室溫(25 ℃)顯色15 min，最后每孔加入100 μL終止液(0.2 M H2SO4)，用酶標(biāo)儀檢測(cè) 450 nm處的波長(zhǎng)。用Aptamer/PicoGreen ZEN檢測(cè)方法和ELISA法檢測(cè)牛奶樣品，計(jì)算2種方法之間的 Kappa 值[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PicoGreen與ZEN核酸適配體形成雙鏈DNA的反應(yīng)條件檢測(cè)

檢測(cè)PicoGreen與ZEN核酸適配體形成雙鏈DNA的反應(yīng)條件首先需要確定PicoGreen與緩沖液、核酸適配體DNA單鏈、互補(bǔ)鏈單鏈、核酸適配體與互補(bǔ)鏈雜交形成的雙鏈DNA之間是否會(huì)單獨(dú)反應(yīng)并釋放熒光，以及確定該熒光是否能被捕捉以用于實(shí)際應(yīng)用中的檢測(cè)。結(jié)果表明，PicoGreen與雙鏈DNA雜交產(chǎn)物能夠很好的結(jié)合并產(chǎn)生較強(qiáng)熒光，可用熒光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)(圖2)。因此，本文建立的利用PicoGreen染料與雙鏈核酸結(jié)合的特性，使用核酸適配體方法檢測(cè)ZEN所需的反應(yīng)條件滿足該技術(shù)的開發(fā)要求。

圖2 ZEN核酸適配體形成的雙鏈DNA與PicoGreen結(jié)合后的熒光檢測(cè)

2.2 PicoGreen釋放熒光峰值時(shí)間

該檢測(cè)方法中，加入反應(yīng)體系的PicoGreen為固定值，因此需要確定在特定濃度下熒光強(qiáng)度達(dá)到峰值的時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果表明，雙鏈DNA與PicoGreen結(jié)合后所激發(fā)產(chǎn)生的熒光立刻達(dá)到最大值，隨后熒光強(qiáng)度逐漸減弱(激發(fā)波長(zhǎng)：480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：520 nm)。主要原因是存在于反應(yīng)體系中雙鏈DNA全部與PicoGreen結(jié)合并釋放出熒光以后，隨著時(shí)間的推移，PicoGreen逐漸分解，使熒光信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱。由圖3可知，被測(cè)物加入PicoGreen后，PicoGreen與雙鏈結(jié)合并釋放熒光，激發(fā)熒光值隨即達(dá)到最大值，隨著反應(yīng)時(shí)間的推移，熒光強(qiáng)度逐漸減弱。且在圖3中還可以看出，核酸適配體的濃度越大，結(jié)合的雙鏈DNA越多，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。因此，后續(xù)的檢測(cè)技術(shù)開發(fā)中，選擇40 nM核酸適配體和加入PicoGreen后隨即檢測(cè)的方法。

圖3 PicoGreen與雙鏈DNA最佳反應(yīng)時(shí)間的確定

2.3 ZEN檢測(cè)的靈敏度試驗(yàn)

一種檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)，其靈敏度是一個(gè)重要參數(shù)，又稱最低檢測(cè)限或敏感性。試驗(yàn)結(jié)果表明，反應(yīng)體系中加入的ZEN初始質(zhì)量濃度越大，熒光檢測(cè)儀能夠檢測(cè)到的PicoGreen與雙鏈結(jié)合所釋放出的熒光信號(hào)就會(huì)越小。因核酸適配體的濃度固定不變，因此，與ZEN結(jié)合的核酸適配體越多，剩余能結(jié)合于適配體互補(bǔ)鏈的ZEN核酸適配體就會(huì)越少，能與PicoGreen結(jié)合的雙鏈DNA的量也會(huì)隨之減少，激發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)度也會(huì)逐漸減弱。試驗(yàn)結(jié)果表明，該檢測(cè)方法的檢測(cè)下限為0.1 μg/L(0.1 ppb)，線性范圍為 0.1～1 μg/L(0.1～1 ppb)(圖4)。

圖4 ZEN 的靈敏度檢測(cè)

2.4 基于核酸適配體的熒光檢測(cè)法檢測(cè)ZEN的特異性

在檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)過程中，評(píng)價(jià)其好壞的一個(gè)重要標(biāo)志就是特異性。特異性又叫做交叉反應(yīng)性。本文主要針對(duì)食品與農(nóng)作物中毒性較大的幾種霉菌毒素分別進(jìn)行了檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明，加入PicoGreen后檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度較強(qiáng)的是 CTN、AFB1、FB1、OTA 4種毒素。在加入同樣濃度ZEN的反應(yīng)體系中，檢測(cè)的熒光強(qiáng)度則較弱。這恰恰說明，當(dāng)反應(yīng)體系中加入ZEN時(shí)，ZEN核酸適配體就會(huì)與其發(fā)生特異性結(jié)合，只剩余少量核酸適配體與互補(bǔ)鏈結(jié)合形成雙鏈DNA。另外4種毒素不能與ZEN核酸適配體結(jié)合，因此反應(yīng)體系中核酸適配體就會(huì)全部與其互補(bǔ)鏈結(jié)合形成雙鏈DNA，產(chǎn)生大量雙鏈DNA，所激發(fā)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。因此，該試驗(yàn)選用的核酸適配體能特異性識(shí)別并結(jié)合ZEN，與CTN、AFB1、FB1或OTA不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)(圖5)。

圖5 基于核酸適配體與PicoGreen檢測(cè)ZEN 的特異性試驗(yàn)

2.5 對(duì)照ELISA檢測(cè)方法是否具有一致性

目前，抗原-抗體檢測(cè)方法仍然是檢測(cè)ZEN最常用的方法，此方法的優(yōu)勢(shì)就在于具有較高的靈敏度和特異性，但也具有成本高、抗體保存要求高、容易變性等缺點(diǎn)。本文建立的檢測(cè)方法在彌補(bǔ)這些缺點(diǎn)的同時(shí)也具有和ELISA方法相似的靈敏度和特異性。為判定本文建立的檢測(cè)方法與ELISA方法是否具有一致性，該試驗(yàn)通過牛奶樣品中添加ZEN的方法制備樣品并檢測(cè)其熒光值和波長(zhǎng)值，計(jì)算回收率(表2)。檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)ZEN毒素的質(zhì)量濃度較低時(shí)，相應(yīng)回收率也較低。當(dāng)濃度為10 μg/L時(shí)，回收率達(dá)到87.94%和96.52%(表3)。比較2種方法，計(jì)算得到的Kappa值為0.805(檢測(cè)樣品濃度分別為0、1、2、2.5、5、10 μg/L)，表明2種方法的檢測(cè)結(jié)果具有良好的一致性(表3)。因此，本文建立的基于核酸適配體和PicoGreen的檢測(cè)方法可應(yīng)用于樣品中ZEN的檢測(cè)。

表2 2種檢測(cè)方法回收率的比較

表3 Kappa 值

3 討論與結(jié)論

目前，國(guó)內(nèi)食品受生物毒素、農(nóng)藥、獸藥污染問題嚴(yán)重。雖然國(guó)家和政府已高度重視并做了大量工作，但執(zhí)行情況卻差強(qiáng)人意。導(dǎo)致該問題的原因之一就是沒有普及一種合適的檢測(cè)方法。目前玉米赤霉烯酮的檢測(cè)方法較常用的有薄層層析法、高效液相色譜法和氣相色譜法，但這幾種方法對(duì)檢測(cè)樣品前期處理要求都比較高，前處理過程也較繁瑣，且儀器設(shè)備昂貴。而基于熒光染料PicoGreen和核酸適配體的ZEN檢測(cè)方法是一種可靠、準(zhǔn)確、特異、快速、低成本的檢測(cè)方法，特別適用于基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)大批量樣品的快速篩選和檢測(cè)，在我國(guó)具有廣闊的應(yīng)用前景。

在特異性檢測(cè)方面，與ZEN最為相似的是α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇是ZEN的代謝產(chǎn)物，多在潮濕、腐爛的環(huán)境中出現(xiàn)。在谷物中，α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇的總量較ZEN的含量低，目前在谷物中還沒有相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和限量。因此，在實(shí)際的檢測(cè)過程中，玉米赤霉烯醇的存在對(duì)于ZEN的檢測(cè)影響不大，而且即使出現(xiàn)交叉反應(yīng)也只體現(xiàn)在ZEN及其衍生物的總量上，所以本文沒有對(duì)這2種物質(zhì)進(jìn)行特異性檢測(cè)。本文選擇谷物中污染率較高、危害較大的真菌毒素，如CTN、AFB1、OTA、FB1等作為特異性比較的抗原。這些毒素在抗原結(jié)構(gòu)上與ZEN具有一定的相似性，測(cè)定其交叉反應(yīng)是為今后同時(shí)進(jìn)行多種真菌毒素檢測(cè)時(shí)，能最大限度地消除它們之間的相互干擾，從而對(duì)每一種真菌毒素進(jìn)行精準(zhǔn)的定量。試驗(yàn)結(jié)果表明ZEN核酸適配體具有高度特異性，不會(huì)與這些真菌毒素出現(xiàn)交叉反應(yīng)(圖5)，本文建立的ZEN檢測(cè)方法的檢測(cè)下限為0.1 μg/L(圖4)。

本文檢測(cè)的回收率是通過牛奶樣品中添加已知濃度的ZEN后測(cè)得。在實(shí)際檢測(cè)中，這些樣品需要進(jìn)行萃取回收，在回收之后才能按照上述的方法進(jìn)行ZEN的檢測(cè)。初始樣品中ZEN的含量越低，回收率就會(huì)越低。如果樣品中ZEN的濃度達(dá)到10 μg/L(μg/kg)時(shí)，回收率達(dá)到87.94%和96.52%(表2)。動(dòng)物性飼料和食品中ZEN最大殘留限量分別為2 000和1 000 μg/kg，大于10 μg/L(μg/kg)。因此，本文建立的ZEN檢測(cè)方法符合該標(biāo)準(zhǔn)，可用于樣品中ZEN的快速檢測(cè)。

核酸適配體是一種單鏈DNA，因能夠與堿基一一對(duì)應(yīng)并識(shí)別的特性，已被廣泛應(yīng)用在各類生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域中。本文中應(yīng)用的ZEN核酸適配體特異性較高，不會(huì)與一些常見的真菌毒素，如CTN、AFB1、FB1、OTA等出現(xiàn)交叉反應(yīng)?；谶m配體和PicoGreen檢測(cè)ZEN方法的靈敏度為0.1 μg/L，與目前常用的檢測(cè)方法ELISA法相比也具有高度的一致性，Kappa值為0.805(表3)。本文建立的檢測(cè)方法可以在40 min內(nèi)完成，且具有穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、易于判定，具備快速、易操作、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。在現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品的快速檢測(cè)中可以體現(xiàn)出其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，而且原理和方法都十分簡(jiǎn)單，適合在基層推廣應(yīng)用。