串聯(lián)重復(fù)序列在高粱基因組中的特征及分布

趙志新，李春鑫，李雨嬌

(1.商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 小麥研究所 分子育種研究室，河南 鄭州 450002)

高粱[Sorghumbicolor(L) Moench]為禾本科高粱族高粱屬植物，是一種綜合利用價(jià)值高的糧食、飼料等多用途的農(nóng)作物[1]。高粱適應(yīng)能力強(qiáng)，具有較強(qiáng)的抗旱、耐寒、耐鹽堿等特性，在干旱和半干旱農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有極其重要的地位，因此，從基因組角度研究重復(fù)序列在高粱中的特征及基因調(diào)控機(jī)制對(duì)高粱分子育種及抗性特征分析具有重要的借鑒意義[2]。

串聯(lián)重復(fù)序列(Tandem repeat,TRs)，主要指1～200 bp的核心重復(fù)單位的重復(fù)序列，其廣泛存在于真核生物和一些原核生物的基因組中，并表現(xiàn)出種屬、堿基組成等的特異性[3]。在同一物種基因組中，串聯(lián)重復(fù)序列在編碼區(qū)和非編碼區(qū)都有分布，并且在非編碼區(qū)大量存在[4]。隨著計(jì)算技術(shù)的進(jìn)步及高通量數(shù)據(jù)分析的出現(xiàn)，重復(fù)序列研究已不僅僅局限于微衛(wèi)星等短重復(fù)序列(通常指1～10 bp)，中等重復(fù)序列(>10 bp)也已經(jīng)被廣泛研究，并且研究顯示，這些重復(fù)序列在植物及綠藻的基因轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)控中扮演著重要的作用[5]。

本研究利用Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)，下載高粱全基因組及基因組注解數(shù)據(jù)，然后使用Phobos軟件分析1～50 bp重復(fù)單元在基因間和基因內(nèi)的密度和分布特征，以便闡明重復(fù)序列在高粱基因組中的特征及可能的生物學(xué)功能。

1 材料和方法

1.1 高粱基因組數(shù)據(jù)的獲得

從Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)(http//www.Phytozome.net/)下載高粱(Sorghumbicolorv2.1)的全基因組及基因注解數(shù)據(jù)。其全基因組為738.54 Mb，有效基因組為697.58 Mb，這里的有效基因組指測(cè)序中可測(cè)的A、T、G、C 4種核苷酸。

依據(jù)真核基因結(jié)構(gòu)圖(圖1)，本研究中每個(gè)基因分為基因內(nèi)區(qū)域[包括5′UTR、CDS(基因編碼區(qū))、Intron(內(nèi)含子)和 3′UTR]和基因間區(qū)域(包括上游基因間隔區(qū)和下游基因間隔區(qū))，主要研究串聯(lián)重復(fù)序列密度及串聯(lián)重復(fù)序列分布[5]特征。

1.2 串聯(lián)重復(fù)序列的檢測(cè)和分析

為了搜索完美匹配和不完美匹配的串聯(lián)重復(fù)序列，使用全基因組串聯(lián)重復(fù)序列的搜索工具(Phobos version 3.3.12)[6]。考慮所需處理高粱基因組的計(jì)算資源和執(zhí)行時(shí)間，采用1～50 bp作為重復(fù)單位的大小，檢測(cè)重復(fù)序列的最小長(zhǎng)度被設(shè)定為12 bp。對(duì)于循環(huán)的串聯(lián)重復(fù)序列，按照字母順序只有一個(gè)序列模體被選擇為代表[5]，例如AAG、AGA和GAA都是(AAG)n的重復(fù)單元。此外，分別檢測(cè)串聯(lián)重復(fù)序列以及它的反向互補(bǔ)序列(例如，AAG和CTT)，這是因?yàn)檎満拓?fù)鏈上的基因涉及到正義和反義轉(zhuǎn)錄[7]，因此需要強(qiáng)調(diào)基因定位(正鏈或負(fù)鏈)的重要性，類似的策略已經(jīng)被他人采用[8]。

串聯(lián)重復(fù)序列的密度被定義為每兆堿基對(duì)(Mb)含有的串聯(lián)重復(fù)序列的堿基對(duì)數(shù)(bp/Mb)，表示串聯(lián)重復(fù)序列長(zhǎng)度在總檢測(cè)序列長(zhǎng)度中所占的比例。為了研究串聯(lián)重復(fù)序列在不同區(qū)域的分布數(shù)量，首先將所研究的基因內(nèi)和基因間區(qū)域長(zhǎng)度規(guī)定為0～99(即百分化)，然后切分為0～9、10～19、……、90～99共10個(gè)子區(qū)域，分別計(jì)算串聯(lián)重復(fù)序列在每一個(gè)子區(qū)域出現(xiàn)的頻數(shù)，這樣所有基因間和基因內(nèi)區(qū)域的串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)目就具有可比性[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱基因組中1～50 bp串聯(lián)重復(fù)序列的密度分析

在整個(gè)高粱基因組中(697.58 Mb)，5′UTR中的串聯(lián)重復(fù)序列密度最高，為25 655 bp/Mb，其次為UI200(16 761 bp/Mb)和UI500(10 718 bp/Mb)，3′UTR中的串聯(lián)重復(fù)序列密度最低，為5 710 bp/Mb，其余則為6 000 bp/Mb左右。5′UTR和UI200中的串聯(lián)重復(fù)序列密度最高，這可能與啟動(dòng)子的保護(hù)和RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子的識(shí)別有關(guān)(圖2)。

圖2 基因不同區(qū)域串聯(lián)重復(fù)序列密度

全基因組中1～50 bp串聯(lián)重復(fù)序列密度排在前7位的依次是二堿基(1 123 bp/Mb)、三堿基(996 bp/Mb)、六堿基(650 bp/Mb)、二十一堿基(510 bp/Mb)、四堿基(438 bp/Mb)、五堿基(278 bp/Mb)和單堿基(253 bp/Mb)，其中除了二十一堿基，其余全是微衛(wèi)星DNA(圖3)。二堿基和三堿基為主要的重復(fù)單元，其密度分別占總密度的17.04%和15.12%。二堿基重復(fù)類別中，密度最大為AT (746 bp/Mb)，CG (9 bp/Mb)密度最小。三堿基重復(fù)類別中，重復(fù)密度較大的為ATT (108 bp/Mb)和AAT (107 bp/Mb)，密度較小的為GAT (21 bp/Mb)和GGT (20 bp/Mb)。

圖3 高粱基因組中1～50 bp串聯(lián)重復(fù)序列密度

2.2 基因內(nèi)不同區(qū)域1～50 bp串聯(lián)重復(fù)序列的密度分析

真核基因結(jié)構(gòu)主要包括5′UTR、CDS、Intron和3′UTR等區(qū)域，這些區(qū)域與DNA的轉(zhuǎn)錄(如開(kāi)放閱讀框，ORF)、翻譯密切相關(guān)。

2.2.1 串聯(lián)重復(fù)序列1～50 bp的重復(fù)單元在5′UTR中的密度 如圖4所示，5′UTR中重復(fù)密度從高到低主要為三堿基(8 949 bp/Mb)、二堿基(4 064 bp/Mb)、五堿基(3 897 bp/Mb)、六堿基(3 773 bp/Mb)和四堿基(2 821 bp/Mb)，它們占總密度的91.62%。其中三堿基重復(fù)密度最大，占總密度的34.88%，且CCG(3 127 bp/Mb)為最高的重復(fù)模體。在二堿基重復(fù)單元中，AG(1 702 bp/Mb)、CT(1 585 bp/Mb)重復(fù)模體最高，GT(72 bp/Mb)最小?？梢?jiàn)，在5′UTR中，重復(fù)序列主要為短的2～6 bp的微衛(wèi)星重復(fù)，且主要為富含CG的重復(fù)模體。

圖4 5′UTR中不同重復(fù)單元的密度

2.2.2 串聯(lián)重復(fù)序列1～50 bp的重復(fù)單元在CDS中的密度 由圖5知，CDS中重復(fù)序列最高的為三堿基重復(fù)(3 334 bp/Mb)，占總重復(fù)序列的53.96%，其次為六堿基重復(fù)(1 599 bp/Mb)，占總的25.87%，二者合計(jì)高達(dá)79.83%。在三堿基重復(fù)模體中，CGG(800 bp/Mb)和CCG(673 bp/Mb)最高，而AAT和GTT最低，均為1 bp/Mb。六堿基重復(fù)模體與三堿基重復(fù)類似，最高的為富含CG的CCGGCG (113 bp/Mb)。其余的重復(fù)單元主要為十二堿基(127 bp/Mb)、九堿基(96 bp/Mb)、十八堿基(92 bp/Mb)等，它們均為3 bp的倍數(shù)。由于CDS是蛋白質(zhì)的編碼序列，這可能與三聯(lián)體密碼子的翻譯有關(guān)。

圖5 CDS中不同重復(fù)單元的密度

2.2.3 串聯(lián)重復(fù)序列1～50 bp的重復(fù)單元在Intron中的密度 高粱基因組Intron中，1～50 bp的重復(fù)單元主要是二堿基(1 613 bp/Mb)、單堿基(759 bp/Mb)、三堿基(654 bp/Mb)、四堿基(603 bp/Mb)、五堿基(440 bp/Mb)和六堿基(433 bp/Mb)等微衛(wèi)星DNA(圖6)。其中二堿基占總密度的24.40%，單堿基為11.48%，二者合計(jì)占總密度的35.88%。在二堿基重復(fù)單元中，AT重復(fù)模體密度最高(821 bp/Mb)，AG、GT、AC重復(fù)密度相近(200 bp/Mb)，CG重復(fù)密度最小(14 bp/Mb)。故可知，Intron中主要為富含AT的微衛(wèi)星序列重復(fù)(1～6 bp)，其他長(zhǎng)堿基的重復(fù)單元較少。

圖6 Intron中不同重復(fù)單元的密度

2.2.4 串聯(lián)重復(fù)序列1～50 bp的重復(fù)單元在3′UTR中的密度 3′UTR區(qū)為非翻譯區(qū)，與基因序列中5′UTR相對(duì)，它含有編碼一段蛋白質(zhì)的終止信號(hào)和Poly(A)信號(hào)，這一區(qū)域主要負(fù)責(zé)基因轉(zhuǎn)錄的終止。由圖7知，在3′UTR中，重復(fù)堿基的主要類別是三堿基(1 148 bp/Mb)、二堿基(1 104 bp/Mb)、四堿基(863 bp/Mb)和五堿基(582 bp/Mb)，合計(jì)占總密度的64.75%。在三堿基重復(fù)單元中，重復(fù)密度最大為GCT(163 bp/Mb)和GTT(141 bp/Mb)，最小為ATC(11 bp/Mb)和ACC(8 bp/Mb)；在二堿基重復(fù)單元中，AT(404 bp/Mb)和GT(349 bp/Mb)為優(yōu)勢(shì)重復(fù)堿基，AG(38 bp/Mb)和CG(26 bp/Mb)為弱勢(shì)堿基?？梢?jiàn)，3′UTR 類似于5′UTR，重復(fù)序列主要為富含GT的2～5 bp的微衛(wèi)星重復(fù)。

圖7 3′UTR中不同重復(fù)單元的密度

2.3 基因間不同區(qū)域1～50 bp串聯(lián)重復(fù)序列的密度分析

基因間序列指基因編碼區(qū)的上游序列和下游序列，它們含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的元件，如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、弱化子、沉默子等屬于非編碼區(qū)，目前對(duì)它們的研究不多，但是在非編碼區(qū)中存在大量重復(fù)序列。

2.3.1 串聯(lián)重復(fù)序列1～50 bp的重復(fù)單元在上游序列中的密度 基因序列的上游區(qū)分為3個(gè)區(qū)，UI200(5′UTR之前的200 nt，指1～200 nt)、UI500(5′UTR之前500 nt，指201～700 nt)、UI1000(5′UTR之前1 000 nt，指701～1 700 nt)。該區(qū)域一般含有調(diào)控轉(zhuǎn)錄的元件，如啟動(dòng)子等。

在UI200中，二堿基(3 612 bp/Mb)和三堿基(3 437 bp/Mb)重復(fù)密度占總重復(fù)密度的42.05%。在二堿基重復(fù)單元中，優(yōu)勢(shì)模體為AT (1 170 bp/Mb)和CT (1 075 bp/Mb)，弱勢(shì)模體為GC (73 bp/Mb)；在三堿基重復(fù)單元中，優(yōu)勢(shì)模體是CCG (627 bp/Mb)和CCT (565 bp/Mb) ，弱勢(shì)模體為AAC (6 bp/Mb)(圖8A)。可知，二堿基重復(fù)主要為富含AT的模體，而三堿基則為富含CG的模體。

在UI500中，二堿基(2 757 bp/Mb)和三堿基(1 395 bp/Mb)重復(fù)密度占總重復(fù)密度的38.74%。在二堿基重復(fù)單元中，AT (1 504 bp/Mb)為優(yōu)勢(shì)模體，而CG(35 bp/Mb)屬于弱勢(shì)模體；在三堿基重復(fù)單元中，ATT (173 bp/Mb )為優(yōu)勢(shì)模體，弱勢(shì)模體是GTT (10 bp/Mb)(圖8B)。可知在UI500中，二堿基和三堿基重復(fù)均為富含AT的模體。

類似于UI500，在UI1000中，二堿基(2 184 bp/Mb)和三堿基(1 153 bp/Mb)重復(fù)密度占總重復(fù)密度的38.59%。在二堿基重復(fù)單元中，優(yōu)勢(shì)模體為AT (1 336 bp/Mb)，弱勢(shì)模體為CG (14 bp/Mb)；在三堿基重復(fù)單元中，優(yōu)勢(shì)模體為ATT (188 bp/Mb)，弱勢(shì)模體為GGT (22 bp/Mb)(圖8C)。可知在UI1000中，二堿基和三堿基重復(fù)均為富含AT的模體。

在基因上游3個(gè)不同區(qū)域中，高重復(fù)密度的單元主要為1～7 bp，屬于微衛(wèi)星序列，其他重復(fù)單元較低。與UI500和UI1000相比， UI200重復(fù)單元的種類較少(只有30種)，但密度較大，這或許與UI200和5′UTR位置較近有關(guān)系，此位置主要為啟動(dòng)子的調(diào)控區(qū)域，可能與轉(zhuǎn)錄起始及調(diào)控有關(guān)。

2.3.2 串聯(lián)重復(fù)序列1～50 bp的重復(fù)單元在下游序列中的密度 基因序列的下游區(qū)分為3個(gè)區(qū)，DI200(3′UTR之后200 nt，指1～200 nt)、DI500(3′UTR之后500 nt，指201～700 nt)、DI1000(3′UTR之后1 000 nt，指701～1 700 nt)。該區(qū)域一般含有調(diào)控轉(zhuǎn)錄的終止元件，如Poly(A)位點(diǎn)等。

在DI200中，二堿基(856 bp/Mb)和三堿基(684 bp/Mb)重復(fù)密度占總重復(fù)密度的24.41%。在二堿基重復(fù)單元中，優(yōu)勢(shì)模體為AG (293 bp/Mb)和AT (215 bp/Mb)，弱勢(shì)模體為AC (25 bp/Mb)；在三堿基重復(fù)單元中，優(yōu)勢(shì)模體是ATT (106 bp/Mb)和CGG (100 bp/Mb)，弱勢(shì)模體為ATC (5 bp/Mb)和GAT (5 bp/Mb)(圖9A)。可知，二堿基和三堿基重復(fù)沒(méi)有明顯的偏向性。

在DI500中，二堿基(848 bp/Mb)重復(fù)為主要的重復(fù)單元，占總重復(fù)密度的13.29%。在二堿基重復(fù)單元中，AT (295 bp/Mb)為優(yōu)勢(shì)模體，而CG(13 bp/Mb)屬于弱勢(shì)模體(圖9B)?？芍赨I500中，二堿基重復(fù)主要為富含AT的模體。

在DI1000中，三堿基(717 bp/Mb)和二堿基(701 bp/Mb)重復(fù)密度占總重復(fù)密度的22.67%。在三堿基重復(fù)單元中，優(yōu)勢(shì)模體為CGG (90 bp/Mb)和CCG (90 bp/Mb)，弱勢(shì)模體為GAT (3 bp/Mb)；在二堿基重復(fù)單元中，AT (241 bp/Mb)為優(yōu)勢(shì)模體，而CG(25 bp/Mb)屬于弱勢(shì)模體(圖9C)?？芍贒I1000中，三堿基為富含CG的模體，而二堿基重復(fù)主要為富含AT的模體。

不同于基因上游區(qū)域，在高粱基因組下游區(qū)域中，雖然1～7 bp的重復(fù)單元密度較高，但其密度的絕對(duì)值(150～850 bp/Mb)遠(yuǎn)小于基因上游區(qū)域(250～3 600 bp/Mb)。與上游區(qū)域相比，下游區(qū)域大于10 bp重復(fù)單元的重復(fù)密度明顯較高。

圖8 基因上游序列不同重復(fù)單元的密度

圖9 基因下游序列不同重復(fù)單元的密度

2.4 高粱基因組串聯(lián)重復(fù)序列在各個(gè)特征序列的分布

2.4.1 串聯(lián)重復(fù)序列在基因內(nèi)的分布 圖10顯示1～50 bp串聯(lián)重復(fù)序列在基因內(nèi)不同區(qū)域的分布情況。在5′UTR和CDS中，串聯(lián)重復(fù)序列較均勻地分布于除兩端以外的區(qū)域(>9.83%)，兩端分布較低(<9.14%)，特別是在5′UTR中。在Intron中，兩端的串聯(lián)重復(fù)序列分布較多(10%左右)，而中間60～69部位則最低(9.17%)，由于Intron的兩端緊靠著CDS，這可能與Intron的識(shí)別、剪接有關(guān)。與Intron相反，在3′UTR中，重復(fù)序列主要分布于中間，特別是在60～69部位最高(12.84%)，兩端則較低(接近9%)。

圖10 串聯(lián)重復(fù)序列頻率在基因內(nèi)的分布

2.4.2 串聯(lián)重復(fù)序列在基因間的分布 在上游基因間隔區(qū)中，如圖11，在UI200、UI500、UI1000中，距離基因5′UTR端越遠(yuǎn)，串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)量越少。在UI200和UI500中表現(xiàn)尤為明顯，其最大與最小值分別相差2.55倍(UI200, 12.32/4.83)和1.72倍(UI500, 12.62/7.32)。

圖11 串聯(lián)重復(fù)序列頻率在上游基因間隔區(qū)的分布

類似于上游基因間隔區(qū)，在下游基因間隔區(qū)內(nèi)，距離基因3′UTR端越遠(yuǎn)，串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)量也越少(圖12)。特別是在3′UTR下游1～700 bp內(nèi)(DI200和DI500)，靠近3′UTR端串聯(lián)重復(fù)序列分布較高，遠(yuǎn)離3′UTR端其分布逐漸降低，其最大與最小值相差1.99倍(DI200,13.02/6.54)和1.57倍(DI500,11.63/7.39)。而在DI1000區(qū)域內(nèi)，串聯(lián)重復(fù)序列分布逐漸降低的趨勢(shì)則不明顯，可能揭示此區(qū)域與3′UTR轉(zhuǎn)錄終止相關(guān)性已較弱。

圖12 串聯(lián)重復(fù)序列頻率在下游基因間隔區(qū)的分布

3 結(jié)論與討論

3.1 串聯(lián)重復(fù)序列在高粱基因組中的密度

在不同區(qū)域微衛(wèi)星重復(fù)單元類別中(1～6 bp)，主要是二堿基和三堿基等微衛(wèi)星，占總密度的30%以上，而單堿基重復(fù)單元密度不高，同時(shí)部分長(zhǎng)堿基的重復(fù)單元密度也不低，說(shuō)明高粱基因組中重復(fù)單元的出現(xiàn)不是隨機(jī)的，而是有一定的自然選擇性，這與他人的研究結(jié)果相一致[3,5-6]。

已知重復(fù)序列在5′UTR、UI200和UI500中的密度較高，其余區(qū)域密度差別不大。就區(qū)域基因組大小而言，UI200基因組為2.73 Mb、5′UTR基因組為2.06 Mb，但其微衛(wèi)星(1～6 bp)的重復(fù)密度高達(dá)80%以上，而Intron基因組為43.56 Mb，其微衛(wèi)星重復(fù)密度只有35.88%。顯然微衛(wèi)星重復(fù)密度與基因組大小沒(méi)有明顯關(guān)系，可能與它所在位置的功能有關(guān)[3]。

本研究顯示，高粱基因組中最高和次高的串聯(lián)重復(fù)序列密度在5′UTR和它的直接上游區(qū)域，即UI200區(qū)，而這個(gè)區(qū)域通常為啟動(dòng)子區(qū)域。5′UTR被認(rèn)為是串聯(lián)重復(fù)序列的熱點(diǎn)區(qū)域，之前的研究表明，5′UTR中的串聯(lián)重復(fù)序列可參與轉(zhuǎn)錄或翻譯的調(diào)控[5-6,9]。CDS中串聯(lián)重復(fù)序列的密度較低，低密度的重復(fù)序列會(huì)降低蛋白質(zhì)的復(fù)雜性從而增強(qiáng)其保守度，已經(jīng)證實(shí)CDS的突變會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能改變，功能喪失和蛋白質(zhì)截短[10]。3′UTR和內(nèi)含子中的串聯(lián)重復(fù)序列密度也較低，可能暗示重復(fù)序列在這些區(qū)域保守度高，參與的生物學(xué)功能也可能較少[5]。

3.2 串聯(lián)重復(fù)序列在高粱基因組中的位置分布

從重復(fù)序列在高粱基因內(nèi)及基因間的分布可以看出，重復(fù)序列在整個(gè)基因組中的位置也并非隨機(jī)存在，這與此前研究相一致[3]?；蜷g隔區(qū)的串聯(lián)重復(fù)序列的分布明顯偏向于靠近基因兩端(5′UTR和3′UTR)，串聯(lián)重復(fù)序列已經(jīng)被定位到基因和基因調(diào)節(jié)區(qū)，并參與轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控[11]，本研究顯示，串聯(lián)重復(fù)序列偏向基因調(diào)節(jié)區(qū)，也支持了這一觀點(diǎn)。另外，Intron兩端的串聯(lián)重復(fù)序列分布較高，考慮到可能與內(nèi)含子剪接有關(guān)[9]，也可對(duì)與其相鄰的CDS起到保護(hù)的作用。

本研究顯示，串聯(lián)重復(fù)序列在基因不同區(qū)域具有顯著的特征差異，并且重復(fù)序列的區(qū)域分布與基因調(diào)控具有緊密的聯(lián)系，同時(shí)本研究將有助于對(duì)串聯(lián)重復(fù)序列進(jìn)化及在基因表達(dá)中調(diào)控作用的理解。但由于計(jì)算資源的局限性(如CPU、內(nèi)存和運(yùn)算時(shí)間)，本研究只探究了1～50 bp重復(fù)序列，而對(duì)于更長(zhǎng)的重復(fù)序列(>50 bp)進(jìn)行研究或許能揭示更多潛在的重復(fù)序列功能。