抗病毒口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)改進(jìn)研究Δ

邱陳勁，孟 鶴，謝小燕，劉瀟瀟，陳佩文，楊志業(yè)

(1.廣東省藥品檢驗(yàn)所中藥室，廣東 廣州 510180； 2.廣州市香雪制藥股份有限公司研發(fā)部，廣東 廣州 510530)

抗病毒口服液為非處方藥，處方包括板藍(lán)根、石膏、知母、連翹、石菖蒲、廣藿香、郁金、地黃及蘆根等9味藥材，具有清熱祛濕、涼血解毒之功效，用于風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱及上呼吸道感染，流行性感冒、腮腺炎病毒感染等疾病，被收載于《中華人民共和國(guó)藥典：一部》(2015年版)。市場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由于連翹葉成本低，有用連翹葉代替連翹的違規(guī)投料現(xiàn)象，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)無法對(duì)其進(jìn)行控制；板藍(lán)根作為君藥，(R，S)-告依春作為抗病毒活性的指標(biāo)性成分，未對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定控制。故本研究增加了(R，S)-告依春、連翹酯苷A和連翹苷的定性指紋圖譜及其含量測(cè)定，以進(jìn)一步有效控制抗病毒口服液的質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；色譜柱：Waters CORTECS C18柱(150 mm×4.6 mm，2.7 μm)；Sartorius CP224S型電子天平(德國(guó)賽多利斯集團(tuán))；KQ-300DA型超聲波清洗器(昆山舒美)。

1.2 藥品與試劑

供試品：14家企業(yè)提供的40批抗病毒口服液樣品。對(duì)照品：(R，S)-告依春對(duì)照品，批號(hào)為111753—201304，來源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；連翹苷對(duì)照品，批號(hào)為110821—201514，來源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；連翹酯苷A對(duì)照品，批號(hào)為111810—201405，來源于中國(guó)食品藥品檢定研究院。板藍(lán)根陰性樣品、連翹陰性樣品為自制。甲醇、乙腈為色譜純；正丁醇、磷酸為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)方法

2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：色譜柱為Waters CORTECS C18柱(150 mm×4.6 mm，2.7 μm)；流動(dòng)相A為0.1%磷酸溶液為，流動(dòng)相B為甲醇，流動(dòng)相C為乙腈[1]，梯度洗脫(見表1)；流速1 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)236 nm[2]；柱溫29 ℃。理論塔板數(shù)按(R，S)-告依春計(jì)算應(yīng)不低于5 000[3]。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradation elution program

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備：稱取(R，S)-告依春10.54 mg置于20 ml容量瓶，加70%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液Ⅰ[4]。分別稱取連翹酯苷A(含量以94.1%計(jì))、連翹苷(含量以93.5%計(jì))對(duì)照品15.67、8.82 mg，精密稱定，精密量取對(duì)照品溶液Ⅰ3 ml置于50 ml容量瓶，加70%甲醇[5]溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(R，S)-告依春、連翹酯苷A和連翹苷含量分別為0.031 6、0.294 9[6]和0.164 9[7]mg/ml的對(duì)照品混合溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備：精密量取抗病毒口服液樣品25 ml，用飽和正丁醇振搖提取4次[8]，每次25 ml[9]，合并正丁醇層，60 ℃下減壓回收至干[10]，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 ml容量瓶中，加70%甲醇至刻度[11]，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 高效液相色譜圖：分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各5 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜圖，見圖1。

A.對(duì)照品混合溶液；B.供試品溶液；C.板藍(lán)根陰性樣品溶液；D.連翹陰性樣品溶液A.mixed solution for reference; B.solution for testing product; C.negative sample solution with radix isatidis; D.negative sample with fructus forsythiae圖1 高效液相色譜圖(液相色譜儀品牌：Agilent)Fig 1 High performance liquid chromatography (brand of liquid chromatograph: Agilent)

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 儀器精密度試驗(yàn)：取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液連續(xù)6次進(jìn)樣，結(jié)果顯示，所得峰面積的RSD為0.5%，說明儀器精密度良好。

2.2.2 線性關(guān)系考察：稱取(R，S)-告依春10.54 mg置于20 ml容量瓶，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液Ⅰ。分別精密稱定連翹酯苷A(含量以94.1%計(jì))、連翹苷(含量以93.5%計(jì))對(duì)照品10.39、8.22 mg，置于10 ml容量瓶，精密量取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液Ⅰ2 ml置于上述10 ml容量瓶，加70%甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得(R，S)-告依春、連翹酯苷A和連翹苷含量分別為0.105 4、0.977 7和0.768 6 mg/ml的混合對(duì)照品溶液母液。精密量取混合對(duì)照品溶液母液0.8 ml，置于25 ml容量瓶，加70%甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品混合液Ⅱ；精密量取混合對(duì)照品溶液母液1 ml，置于10 ml容量瓶，加70%甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品混合液Ⅲ；精密量取混合對(duì)照品溶液母液2 ml，置于10 ml容量瓶，加70%甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品混合液Ⅳ；精密量取混合對(duì)照品溶液母液3 ml，置于10 ml容量瓶，加70%甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品混合液Ⅴ。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，線性回歸方程分別為，Y=6.649X+14.31(R2=0.999)；Y=1.045X+23.21(R2=0.999)；Y=1.318X+32.49(R2=1)。結(jié)果顯示，(R，S)-告依春、連翹酯苷A和連翹苷分別在16.86～527.00、156.43～4 888.50和122.97 ～3 842.85 ng范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好[12]。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品25 ml，共6份，精密量取，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定。結(jié)果顯示，(R，S)-告依春的RSD為2.8%(n=6)，連翹酯苷A的RSD為1.0%(n=6)，連翹苷的RSD為0.7%(n=6)。以(R，S)-告依春的保留時(shí)間和峰面積為參照，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積比值基本一致，其RSD均<3.0%，相似度均在0.95以上，符合指紋圖譜的技術(shù)要求，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.2.4 耐用性試驗(yàn)：取同一批號(hào)的供試品溶液，分別注入兩臺(tái)不同的液相色譜儀。結(jié)果顯示，兩臺(tái)儀器測(cè)得的含量相對(duì)偏差均<5%，表明本方法的耐用性良好，見表2、圖2。

表2 不同液相色譜儀的考察結(jié)果Tab 2 Inspection results of different liquid chromatograph

A.對(duì)照品混合溶液；B.供試品溶液A.Mixed solution for reference; B.Solution for testing product圖2 高效液相色譜圖(液相色譜儀品牌：Waters)Fig 2 High performance liquid chromatography (brand of liquid chromatograph: Waters)

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、2、6、12、22及32 h測(cè)定其峰面積。結(jié)果顯示，(R，S)-告依春、連翹酯苷A和連翹苷峰面積的RSD分別為0.4%、0.6%和0.5%。以(R，S)-告依春的保留時(shí)間和峰面積為參照，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積比值基本一致，其RSD均<3.0%，相似度均在0.95以上，符合指紋圖譜的技術(shù)要求，表明儀精密度良好，表明樣品在32 h內(nèi)穩(wěn)定[13]。

2.2.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)：精密吸取抗病毒口服液樣品[已知(R，S)-告依春含量為36.38 μg/ml，連翹酯苷A含量為663 μg/ml，連翹苷含量為170 μg/ml]10 ml，共6份，置于分液漏斗，分別精密加入混合對(duì)照品溶液[每1 ml含(R，S)-告依春0.263 5 mg、連翹酯苷A 4.488 6 mg和連翹苷1.241 7 mg]1.5 ml，自“用飽和正丁醇振搖提取4次”起，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定并計(jì)算加樣回收率及RSD。結(jié)果顯示，(R，S)-告依春、連翹酯苷A和連翹苷的平均加樣回收率分別為89.9%、93.5%和95.1%，RSD分別為2.9%、3.6%和0.8%，表明本方法的準(zhǔn)確度較好。

2.2.7 專屬性試驗(yàn)：分別吸取按“2.2”項(xiàng)下制得的對(duì)照品混合溶液、供試品溶液與陰性樣品溶液各5 μl，注入液相色譜儀。結(jié)果顯示，板藍(lán)根、連翹陰性樣品均無干擾(見圖1)。

2.2.8 樣品含量測(cè)定：用本方法測(cè)定40批次抗病毒口服液中(R，S)-告依春、連翹酯苷A和連翹苷的含量結(jié)果顯示，(R，S)-告依春、連翹酯苷A和連翹苷含量的總平均值分別為25.91、249.35和98.78 μg/ml。

2.3 指紋圖譜的建立及相似度分析

2.3.1 指紋圖譜的建立及共有指紋峰的標(biāo)定：比較各批次供試品的色譜圖，其中9個(gè)色譜峰是共有的，確定為共有指紋峰，見圖2；經(jīng)確認(rèn)，對(duì)照?qǐng)D譜中峰4與峰5之間的大峰為防腐劑山梨酸鉀與苯甲酸鈉的生成峰,見圖3。

2.3.2 指紋圖譜色譜峰的鑒定：經(jīng)過與對(duì)照品比較，鑒定其中色譜峰，峰2為(R，S)-告依春，峰4為芒果苷，峰5為連翹酯苷Ⅰ，峰6為連翹酯苷H，峰7為連翹酯苷A，峰8為松脂酚-4-O-葡萄糖苷，峰9為連翹苷[14]。

2.3.3 抗病毒口服液高效液相指紋圖譜的建立：取40批次抗病毒口服液樣品，分別按供試品溶液的制備與檢驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)，記錄指紋圖譜。以(R，S)-告依春(峰2)為參照峰，計(jì)算得出各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<0.3%，符合指紋圖譜的要求。采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”對(duì)40批次樣品的指紋圖譜進(jìn)行分析，以第1批抗病毒口服液的指紋圖譜作為參照?qǐng)D譜，生成40批次樣品的對(duì)照指紋圖譜(見圖3)。結(jié)果顯示，40批次抗病毒口服液與對(duì)照指紋圖譜相似度的平均值為0.911，具有良好的相似性。經(jīng)確認(rèn)，對(duì)照?qǐng)D譜中峰4與峰5之間的大峰為防腐劑山梨酸鉀與苯甲酸鈉的生成峰，見圖4。40批次樣品高效液相指紋圖譜疊加見圖5。

2.3.4 指紋圖譜耐用性考察：取同一批號(hào)的供試品溶液，分別注入兩臺(tái)不同的液相色譜儀，采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”，以生成的對(duì)照指紋圖譜作為參照?qǐng)D譜，對(duì)兩臺(tái)儀器測(cè)得的樣品指紋圖譜進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，Agilent品牌液相色譜儀得出的相似度為0.869，Waters品牌液相色譜儀得出的相似度為0.868，相對(duì)偏差為0.1%，兩者相似度相近[15]。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在常規(guī)的中藥高效液相色譜質(zhì)量分析中，由于成分測(cè)定往往以其最大波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)[16]，而指紋圖譜往往以出峰最多、豐度較高的波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)，故以往的研究往往將二者獨(dú)立起來。隨著可變波長(zhǎng)的應(yīng)用，可將每類成分的最大波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)，既能滿足指紋圖譜的峰數(shù)和豐度，也能滿足含量測(cè)定的靈敏度；采用可變波長(zhǎng)后，指紋圖譜和多指標(biāo)成分可在同一色譜條件下檢測(cè)。通過比較(R，S)-告依春、連翹酯苷A和連翹苷的紫外光譜掃描及指紋圖譜三維圖，波長(zhǎng)為236 nm時(shí)，定量成分及特征峰的信息量、分離度及各色譜峰相對(duì)比例綜合效果較好，干擾少。

3.2 色譜條件的局限性

本方法存在局限性，例如在考察柱溫變化時(shí)，當(dāng)柱溫為33 ℃時(shí)，(R，S)-告依春含量數(shù)據(jù)偏差較大，二極管陣列檢測(cè)器純度測(cè)定結(jié)果顯示其色譜峰不純[17]，推測(cè)其將后面小雜質(zhì)峰包含其中，只有柱溫為29 ℃時(shí)，方法耐用性、分離度等較好；且所用的色譜柱品牌單一。以上不足有待進(jìn)一步改善。

圖3 對(duì)照指紋圖譜Fig 3 Fingerprint for reference

圖4 防腐劑圖譜Fig 4 Antiseptic atlas

圖5 40批抗病毒口服液的高效液相指紋圖譜Fig 5 HPLC finger-print of 40 batches of antiviral oral liquid

3.3 結(jié)果分析

本方法測(cè)定的40批次抗病毒口服液中連翹苷的含量均比《中華人民共和國(guó)藥典：一部》(2015年版)收載的抗病毒口服液含量測(cè)定中連翹苷的限度高2倍以上[18]，說明本方法中所用的提取溶劑水飽和正丁醇的提取率較高。

本方法在建立指紋圖譜的同時(shí)，采用同一方法測(cè)定了(R，S)-告依春、連翹酯苷A和連翹苷的含量。將指紋圖譜技術(shù)和含量測(cè)定相結(jié)合，為抗病毒口服液的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供了更好的技術(shù)手段，可有效保證產(chǎn)品質(zhì)量的均一、穩(wěn)定，促進(jìn)安全用藥。