激活的STAT3通過上調大鼠脊髓CXCL12的表達參與腰椎間盤髓核突出誘導的持續(xù)疼痛*

李 賀 李 輝 周 紅 張懷奇 肖 思 劉紀文

(中山大學附屬第八醫(yī)院疼痛科，深圳 518033)

腰椎間盤突出癥(lumbar disc herniation, LDH)作為一類常見病、多發(fā)病，是臨床上引起腰腿痛的最主要的病因之一，嚴重影響了病人的工作和生活質量。既往認為髓核的機械壓迫和化學刺激[1,2]及其誘發(fā)的炎癥反應所釋放的IL-1β，IL-6和IL-8等細胞因子[3～5]在椎間盤突出誘導的腰痛和坐骨神經痛中起重要作用，但是LDH誘導痛覺過敏的確切機制并不十分清楚。因此，深入探討該機制對臨床防治LDH誘導的持續(xù)疼痛具有重要的理論和實際意義。趨化因子(chemokine)是一類可以引起白細胞向炎癥部位移行的細胞因子的統(tǒng)稱，部分趨化因子也參與神經系統(tǒng)的部分功能調控[6]。近期有研究發(fā)現(xiàn)：趨化因子CXCL12可由中樞神經系統(tǒng)的神經元和膠質細胞分泌，在神經系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)相互作用中起著至關重要的作用[7]參與神經損傷、化療藥物誘導的多種病理性疼痛的發(fā)生[8,9]。然而脊髓CXCL12是否參與LDH誘導持續(xù)疼痛的發(fā)生尚無文獻報道。有研究發(fā)現(xiàn)，腰椎間盤突出通過激活信號轉導和轉錄激活因子3 (signal transducer and activator of transcription factor 3, STAT3)增強背根神經節(jié)神經元的興奮性誘導的持續(xù)疼痛的發(fā)生[10]，另有研究顯示神經損傷可通過激活脊髓STAT3參與痛覺過敏的發(fā)生，抑制STAT3的活性則顯著緩解神經病理性疼痛[11,12]。但是脊髓STAT3是否參與腰椎間盤突出誘導的持續(xù)疼痛，目前并不清楚?；熕幬锟赏ㄟ^激活轉錄因子STAT3介導趨化因子CXCL12轉錄，上調CXCL12的表達，從而增強脊髓背角神經元的興奮性，誘導痛覺過敏的發(fā)生[8]。因此，我們推測，腰椎間盤突出通過激活脊髓STAT3上調CXCL12的表達介導持續(xù)疼痛的發(fā)生。

本研究自2017年6月至2018年3月采用自體髓核移植的方法建立LDH大鼠模型，以探討：髓核突出對脊髓CXCL12及p-STAT3表達的影響；抗CXCL12中和性抗體對髓核突出引起的痛反應的作用；STAT3活性抑制劑(S3I-201)對髓核突出引起的痛反應及上調CXCL12表達的影響，為進一步闡明LDH誘導持續(xù)疼痛的發(fā)生機制提供新的實驗依據。

方 法

1.實驗動物

實驗采用雄性SD大鼠128只，體質量為200～220 g，由中山大學實驗動物中心提供。動物分別分籠飼養(yǎng)，自由飲食。室溫保持在22℃～25℃，濕度在50%～60%，12小時/12小時白天-黑夜循環(huán)照明。所進行的所有實驗都按盡量減輕動物痛苦的原則并按照有關實驗動物的使用原則操作。

本研究共分為三個實驗：

實驗一隨機分為兩組：假手術組（Sham組）共16只大鼠和模型組（LDH 組）共32只大鼠，分別檢測兩組建模前后的機械撤足閾值以及建模后脊髓CXCL12和p-STAT3的表達；

實驗二隨機分為四組：假手術組（Sham組）、模型組（LDH 組）、中和性抗體 + LDH組（Antibody + LDH組）和IgG + LDH組，每組8只，Antibody + LDH組和IgG + LDH組分別鞘內注射anti-CXCL12 的中和性抗體 8 μg (10 μl)和 IgG 8 μg(10 μl)，建立模型術后連續(xù)注射7天。分別檢測四組大鼠建模前后的機械撤足閾值；

實驗三隨機分為三組：假手術組 （Sham組）、STAT3抑制劑+ LDH組（S3I-201 + LDH組）和溶劑對照+ LDH組（Vehicle + LDH組），每組16只，S3I-201+ LDH組和Vehicle + LDH組分別鞘內注射S3I-201 100 μg (10 μl)和生理鹽水溶液 10 μl，建立模型術后連續(xù)注射7天。分別檢測三組大鼠建模前后的機械撤足閾值以及建模后脊髓CXCL12的表達。

2.鞘內置管

在實驗二和實驗三中，在LDH模型建立之前，先對Antibody + LDH組、IgG + LDH組、S3I-201+LDH組和Vehicle + LDH組大鼠行鞘內導管埋置術。參照Watanabe等人[13]的方法行鞘內導管埋置術。腹腔注射50 mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，俯臥位固定大鼠，L4-S2脊髓節(jié)段沿中線做一縱行切口，將無菌的 PE-10管從L4-L5椎間隙的硬膜下隙向頭端小心插入，使導管尖端置于脊髓腰膨大處，將大鼠置于垂直體位后若導管內有腦脊液流出說明導管尖端位于椎管內，將導管固定于周圍肌肉組織上。最后，逐層縫合周圍肌肉組織，暴露于切口外的導管埋置于皮毛中。鞘內置管術后，立即進行LDH模型置備。

3.模型置備

參照Kawakami等人[14]建立的腰椎間盤突出模型方法，以其L5、L6棘突間為中心，鈍性分離左側椎旁肌肉，行左側第5腰神經下關節(jié)突、第6腰神經上關節(jié)突及第5腰神經椎板切除術，暴露左側第5腰神經背根神經節(jié)；然后于尾部行縱行切口，暴露第2尾椎至第3尾椎間隙后切取髓核組織，并將其置于暴露的第5腰神經背根神經節(jié)，但不要對其造成機械壓迫，后逐層縫合。假手術組僅暴露相應的手術部位，不放置髓核。最后，逐層縫合周圍肌肉組織。

4.行為學測試

為使大鼠適應測試環(huán)境，消除心理因素對測試結果的影響，實驗前每天將大鼠置于透明有機玻璃箱內適應20分鐘，至大鼠洗臉、行走、直立、搔抓等活動停止，共適應3天。行為學測試時用von Frey纖維絲通過箱底金屬網孔對大鼠足底部皮膚施加機械性刺激，von Frey 纖維絲垂直，微彎，在大鼠足心部停留6～8 s。以2.041 g刺激強度為初始刺激強度。如果撤足反應為陰性，則再選用刺激強度呈對數遞增的相鄰von Frey 纖維絲繼續(xù)刺激。如果撤足反應為陽性，則再選擇相鄰遞減的刺激強度給予刺激。大鼠分別于術前1天及術后第7、14、21及28天進行機械撤足閾值測試。采用“up-down”的方法計算機械撤足閾值。

5.藥物

Anti-CXCL12的中和性抗體（8 μg，10 μl；Torrey Pines Biolabs，美國），isotype IgG（8 μg，10 μl；Sigma，美國），STAT3活性抑制劑 S3I-201（100 μg，10 μl；Selleckchem，美國），抗 CXCL12抗體（1:50；Cell Signaling Technology，美國），抗p-STAT3 (Tyr705) 抗體 （1:1 000，Abcam，美國），抗 β-actin 抗體（1:2 000，Cell Signaling Technology，美國） 等。

6.Western blot

實驗一、三中，大鼠行手術及藥物處理后的第7、14、28天，各取8只，采用腹腔注射350 mg/kg的水合氯醛麻醉大鼠，在冰上迅速取出脊髓腰膨大段，分離出術側腰膨大，稱重后加入10倍蛋白裂解液，低溫勻漿30 s后，15 000轉/分離心，30分鐘后取上清液，采用 BCA 蛋白定量試劑盒行蛋白定量。SDS-PAGE分離目的蛋白后轉移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫下封閉PVDF膜2小時后，分別加入抗 CXCL12抗體 (1:50)、抗 p-STAT3 (1:1 000)、抗β-actin抗體 (1:2 000)，4℃孵育過夜。洗膜后加入相應的二抗(1:6 000)，室溫下孵育1小時。洗膜后加入ECL發(fā)光液顯色曝光。采用Image J軟件測定灰度值并進行相關統(tǒng)計分析。

7.統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對結果進行分析，所得計量資料以均數±標準差(±SD)表示，行為學測試結果采用非參數檢驗進行分析，實驗結果的組間比較采用完全隨機設計的單因素方差分析ANOVA和LSD-t檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.腰椎間盤髓核突出誘導大鼠出現(xiàn)機械痛敏，上調大鼠脊髓CXCL12的表達，明顯增加大鼠脊髓STAT3的磷酸化水平

機械痛閾測試結果 （見圖1A）顯示：腰椎間盤髓核突出模型組大鼠的機械痛閾于手術后第7天開始明顯下降，并持續(xù)至實驗結束的第28天，且與假手術組相比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜ 0.01)。上述結果提示，大鼠非壓迫性腰椎間盤髓核突出模型建模成功，大鼠呈現(xiàn)機械痛覺過敏。Western blot結果（見圖1B）顯示：與假手術組比較，腰椎間盤髓核突出模型組大鼠脊髓的CXCL12表達水平于手術后7天明顯升高，并持續(xù)至實驗結束的第28天，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜ 0.01)。Western blot結果（見圖1C）顯示，與假手術組相比較，腰椎間盤髓核突出模型組大鼠脊髓p-STAT3表達水平于手術后第7天明顯升高，并持續(xù)至實驗結束的第28天，差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜ 0.01)。

2.鞘內注射抗CXCL12的中和性抗體顯著緩解腰椎間盤突出誘發(fā)的痛覺過敏

行為學結果（見圖2）顯示：與假手術組相比較，腰椎間盤髓核突出模型組大鼠的機械痛閾于手術后第7天后明顯降低，持續(xù)至實驗結束的第28天，差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜ 0.01)；與鞘內注射IgG的腰椎間盤髓核突出模型組大鼠相比，鞘內注射抗CXCL12的中和性抗體（8 μg，10 μl/天，共7天）組在手術后的第7、14、21和28天的機械撤足閾值顯著升高 (P＜ 0.01)，這表明鞘內注射抗CXCL12的中和性抗體能夠顯著抑制LDH手術引起的機械撤足閾值的降低，提示CXCL12的上調可能參與了大鼠腰椎間盤髓核突出引起的痛覺過敏。

3.抑制STAT3的活化顯著緩解腰椎間盤突出誘導的機械痛覺過敏

行為學結果（見圖3）顯示：與假手術組相比較，腰椎間盤髓核突出模型組大鼠的機械痛閾于手術后第7天后明顯降低，持續(xù)至實驗結束的第28天，差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜ 0.01)；與鞘內注射Vehicle的腰椎間盤髓核突出模型組大鼠相比，鞘內注射 STAT3 活性的抑制劑S3I-201（100 μg，10 μl/天，共7天）組在手術后的第7、14、21和28天的機械撤足閾值顯著升高 (P＜ 0.01)，這表明鞘內注射S3I-201能抑制LDH手術引起的機械撤足閾值的降低，提示脊髓STAT3的激活可能參與了大鼠腰椎間盤髓核突出引起的痛覺過敏。

圖1 大鼠腰椎間盤髓核突出對大鼠機械撤足閾值及脊髓CXCL12表達的影響 (n = 8,x±SD)A:大鼠椎間盤髓核突出手術組(LDH)的機械撤足閾值于術后第7天開始下降并持續(xù)至第28天；B:大鼠椎間盤髓核突出手術組(LDH)的脊髓CXCL12表達于術后第7天開始上調并持續(xù)至第28天。**P＜ 0.01，與假手術組(sham)比較。C:大鼠腰椎間盤髓核突出對脊髓p-STAT3表達的影響。**P＜ 0.01，與假手術組 (sham)相比較。LDH：腰椎間盤突出癥Fig.1 The effect of nucleus pulposus herniation of lumbar intervertebral disk on the paw withdrawal threshold (A) and spinal cord CXCL12 expression (B) in rats (n = 8,x±SD).**P＜ 0.01, compared with sham group.The effect of nucleus pulposus herniation of lumbar intervertebral disk on the expression of p-STAT3 in the spinal cord of rats.**P＜ 0.01, compared with sham group.LDH: lumbar disc herniation.

圖2 抗CXCL12中和性抗體對大鼠腰椎間盤髓核突出引起的痛反應變化的影響 (n = 8,x±SD)**P＜ 0.01, 與假手術組 (sham)比較；##P＜ 0.01，與鞘內注射IgG的LDH (IgG + LDH)組相比較Fig.2 The effect of intrathecal injection of anti-CXC12 neutralizing antibody on the mechanical allodynia induced by nucleus pulposus herniation of lumbar intervertebral disk (n = 8,x±SD)**P＜ 0.01, compared with sham group; ##P＜ 0.01,compared with group IgG + LDH.

圖3 STAT3活性抑制劑S3I-201對大鼠腰椎間盤髓核突出引起的痛反應變化的影響 (n = 8,x±SD)**P＜ 0.01，代表與假手術組(sham)比較；##P＜ 0.01，與鞘內注射溶劑對照的椎間盤突出(Vehicle + LDH)組相比較Fig.3 The effect of intrathecal injection of STAT3 activity inhibitor S3I-201 on the mechanical allodynia induced by nucleus pulposus herniation of lumbar intervertebral disk (n = 8,x±SD)**P＜ 0.01, compared with sham group; ##P＜ 0.01,compared with group Vehicle + LDH.

4.抑制STAT3的活化抑制腰椎間盤突出誘導的CXCL12上調

Western blot結果（見圖4）顯示，與假手術組相比較，手術后第14天，腰椎間盤髓核突出模型組大鼠脊髓p-STAT3表達水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜ 0.01)，而與鞘內應用溶劑對照Vehicle的腰椎間盤髓核突出模型組相比，鞘內應用STAT3活性的抑制劑模型組大鼠CXCL12的表達顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜ 0.01)。以上結果提示腰椎間盤髓核突出可能通過激活脊髓的STAT3調控CXCL12的表達。

圖4 術后第14天，STAT3活性抑制劑S3I-201對大鼠腰椎間盤髓核突出誘導脊髓CXCL12表達變化的影響 (n = 8,x±SD)**P＜ 0.01，與假手術組(Sham)相比較；##P＜ 0.01，與鞘內注射Vehicle的腰椎間盤突出(Vehicle +LDH)組相比較Fig.4 The effect of intrathecal injection of STAT3 activity inhibitor S3I-201 on the expression of CXCL12 induced by nucleus pulposus herniation of lumbar intervertebral disk (n = 8,x±SD)**P＜ 0.01, compared with sham group; ##P＜ 0.01,compared with group Vehicle + LDH.

討 論

CXCL12是一種重要的趨化因子，近年來在神經突觸可塑性方面的研究備受關注。例如CXCL12孵育脊髓可顯著增強脊髓背角微小興奮性突觸后電流的幅度[9]。有研究還發(fā)現(xiàn)初級傳入神經元可釋放CXCL12，然后遷移至脊髓背角調節(jié)傷害性信號的傳導[15]。此外，近期有報道表明，神經損傷或化療后脊髓CXCL12的表達顯著增加，而拮抗CXCL12的受體后顯著緩解痛行為[8,9]。以上提示CXCL12參與了病理性疼痛的發(fā)生，但是CXCL12是否參與LDH誘導的持續(xù)性疼痛并不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)LDH顯著上調了脊髓CXCL12的表達，且應用抗CXCL12的中和性抗體顯著緩解LDH誘導的機械痛敏。這些研究結果進一步擴展了CXCL12在其他形式疼痛中的作用。

STAT3是JAK-STAT信號通路中一種重要的核轉錄因子，p-STAT3在細胞的增殖、分化凋亡及免疫調節(jié)等過程中發(fā)揮著重要作用[16]。眾所周知，STAT3作為一種轉錄因子，參與調節(jié)炎癥和免疫反應，在神經元的退行性變、突觸可塑性和學習記憶等多種神經生物學過程發(fā)揮重要作用。最近研究報道：STAT3還參與了神經病理性疼痛的發(fā)生。例如 神經損傷或化療藥物處理均可顯著激活脊髓STAT3，上調p-STAT3的表達，而抑制STAT3的激活可顯著緩解神經損傷或化療藥物誘導的痛覺過敏[10～12]。我們的研究首次發(fā)現(xiàn)，LDH顯著上調脊髓p-STAT3的水平，STAT3活性抑制劑S3I-201可顯著緩解LDH誘導的機械痛覺過敏。這與最近Zhang等人報道的LDH可誘導背根神經節(jié)STAT3的激活相一致[10]，他們的研究也進一步證實了鞘內注射S3I-201可顯著緩解LDH誘導的觸誘發(fā)痛。這提示STAT3的激活在LDH誘導的痛覺過敏中發(fā)揮至關重要的作用。盡管已有報道表明LDH可顯著上調背根神經節(jié)RAGE表達從而激活STAT3介導痛覺過敏的發(fā)生[10]，但是LDH誘導脊髓STAT3激活的機制目前并不清楚，仍有待進一步研究。此外，鑒于已有研究表明STAT3可調控脊髓CXCL12的表達[9]，我們進一步觀察了抑制劑S3I-201對CXCL12表達的影響，發(fā)現(xiàn)S3I-201可顯著抑制LDH誘導的脊髓CXCL12上調。這些結果進一步提示LDH可能通過激活脊髓STAT3上調CXCL12的表達，進而誘導痛覺過敏的發(fā)生。本研究為深入闡明大鼠LDH誘導的持續(xù)疼痛的發(fā)生機制提供了實驗依據，也為其臨床防治提供了新的思路。