高營養(yǎng)全谷物燕麥濃漿的復(fù)合酶解工藝優(yōu)化

劉先隆，劉磊，賴婷，魏振承，馬永軒，張名位

（1.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510631）（2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部功能食品重點實驗室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州 510610）

燕麥又稱為野麥、雀麥，是一種營養(yǎng)健康和醫(yī)療價值突出的谷物，其含有豐富的β-葡聚糖、纖維素和混合交聯(lián)阿拉伯木聚糖等膳食纖維成分[1]，還富含酚類化合物、不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素[2]。燕麥胚乳細(xì)胞壁多糖的一個重要結(jié)構(gòu)是β-葡聚糖，能降低血中膽固醇含量和血脂含量，有效減緩糖尿病癥狀[3]，其主要有葡萄糖分子以β-（1,4）和β-（1,3）糖苷鍵連接而成[4]。燕麥中的可溶性β-葡聚糖與人體的M細(xì)胞、腸道細(xì)胞和集散控制系統(tǒng)有著非常密切的聯(lián)系，進(jìn)而改善腸道免疫功能，維持腸道穩(wěn)態(tài)[5]。燕麥中的酚類物質(zhì)主要包括酚酸、燕麥蒽酰胺和類黃酮素等[6]，已有大量研究表明酚類物質(zhì)具有抗氧化活性，可以預(yù)防慢性疾病，具有降血糖、降血脂等生理功能[7]。

燕麥?zhǔn)歉缓扇苄驭?葡聚糖的谷物，目前已有許多關(guān)于燕麥加工的前處理工藝、風(fēng)味的研究。已有報道證明，酶解處理能提高谷物中的可溶性膳食纖維含量和游離酚含量[8,9]。因此，可以利用酶解處理的方法來提高燕麥中的可溶性膳食纖維含量及游離酚含量，從而更充分地提高燕麥中營養(yǎng)成分的生物利用率。陳中偉等[10]研究了β-葡聚糖和酚酸在燕麥麩皮（果皮+種皮+糊粉層）和胚乳中的分布，發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖富集在麩皮中，達(dá)8.57%，約是胚乳中濃度的4.5倍；麩皮中p-香豆酸和阿魏酸的含量分別達(dá) 0.098和 1.00 mg/g，分別是胚乳中相應(yīng)含量的24倍和48倍。蛋白質(zhì)和淀粉及其他物質(zhì)與纖維素相連接組成細(xì)胞壁，降低了可溶性膳食纖維的含量[11]。付曉燕等[12]人采用中溫α-淀粉酶和有機(jī)溶劑提取燕麥多酚物質(zhì)，結(jié)果表明和有機(jī)溶劑提取法相比較，經(jīng)過中溫α-淀粉酶輔助提取的多酚提取率提高58.38%。徐康[13]通過糖化酶和淀粉酶水解燕麥，顯著增加了燕麥飲料中可溶性固形物含量，但沒有考察燕麥酶解后酚類物質(zhì)和β-葡聚糖的含量變化。

燕麥飲料的研制過程中發(fā)現(xiàn)，燕麥濃漿不利于溶解，而通過酶解處理能夠很好的降低燕麥溶解的稠度，還能提高燕麥的營養(yǎng)價值，因此，本研究比較了不同前處理后燕麥可溶性β-葡聚糖含量的影響；以游離酚含量和可溶性β-葡聚糖含量為綜合考察指標(biāo)，比較經(jīng)不同酶處理對燕麥酶解效果的影響；通過響應(yīng)面實驗設(shè)計優(yōu)化，以綜合模糊評判值為指標(biāo)，燕麥復(fù)合酶解的工藝條件，旨在為開發(fā)全谷物燕麥濃漿性飲料提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 原材料與試劑

燕麥從廣州市天河區(qū)的超市采購。β-葡聚糖標(biāo)品、剛果紅購買自廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；沒食子酸、福林酚試劑均購自美國Sigma公司；中溫α-淀粉酶（100000 U/g，最適pH 6.5）、高溫α-淀粉酶(100000 U/g，最適pH 5.8～6.8)、酸性蛋白酶（50000 U/g，最適pH 3.0）、中性蛋白酶（50000 U/g，最適pH 7.0）、纖維素酶（5000 IU/g，最適pH 4.5）購自尤特爾生物技術(shù)有限公司，等級均為食品級；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

UV-1800型紫外可見分光光度計，日本島津公司；Eyelan-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化器械株式會社；TD6離心機(jī)，長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；M200型多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan科技有限公司；DS30-Ⅱ型雙螺桿膨化機(jī)，山東賽信膨化機(jī)械有限公司；XFB-1000中藥粉碎機(jī)，吉首市中誠制藥機(jī)械廠；XDW-6BI超微粉碎機(jī)，濟(jì)南達(dá)微機(jī)械有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同前處理對燕麥中可溶性β-葡聚糖含量的影響

將燕麥磨成粉后過60目篩。篩選出提取可溶性β-葡聚糖含量最大的前處理工藝。條件如下：

（1）烘烤工藝條件：燕麥經(jīng)150 ℃烘烤40 min至呈現(xiàn)均勻的黃色。烘烤時經(jīng)常翻動燕麥，使燕麥烘烤均勻并防止烤焦。燕麥烘烤后水分含量約為5～6%。

（2）擠壓膨化工藝條件：參考張冬媛[14]等人的方法并稍有改動。擠壓膨化機(jī)前端、中端和末端溫度分別60 ℃、95 ℃和130 ℃，螺桿轉(zhuǎn)速為300 r/min。燕麥擠壓烘烤之后水分含量約為6%～7%。

（3）高溫α-淀粉酶耦合擠壓膨化工藝條件：酶添加量為0.3%，擠壓膨化條件同上。

（4）超微粉碎工藝條件：燕麥于超微粉碎機(jī)中粉碎時間為60 s/次，共2次，溫度-4 ℃，燕麥超微粉碎后水分含量約為13%～15%。

1.3.2 不同酶處理對燕麥中可溶性β-葡聚糖和酚含量的影響

以可溶性β-葡聚糖含量和游離酚含量為指標(biāo)，考察不同酶（酸性蛋白酶、中性蛋白酶、中溫α-淀粉酶和纖維素酶）處理燕麥中β-葡聚糖含量和游離酚含量的影響。酶解前，燕麥中可溶性β-葡聚糖含量和游離酚含量分別為 2.12±0.02 mg/g DW 和 51.28±0.04 mg/100 g DW。酶解溫度為50 ℃、酶解時間2 h，以下為不同酶的添加量：

（1）中性蛋白酶添加量（pH=7）為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%。

（2）酸性蛋白酶添加量（pH=3）為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%。

（3）中溫α-淀粉酶（pH=6.5）為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%。

（4）纖維素酶（pH=4.5）為0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.12%、0.14%。

1.3.3 不同酶解條件對復(fù)合酶解燕麥中β-葡聚糖和酚含量的影響

（1）酶解溫度：設(shè)定酶解pH為7，酶解時間為2 h，料液比為1∶10，酶解溫度：35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃。

（2）酶解pH：設(shè)定酶解溫度為50 ℃，酶解時間為2 h，料液比為1∶10，酶解pH：5.5、6、6.5、7、7.5、8。

（3）酶解時間：設(shè)定酶解溫度為50 ℃，酶解pH為6.5，料液比為1∶10，酶解時間：0.5、1、1.5、2、2.5、3。

（4）料液比：設(shè)定酶解溫度為50 ℃，酶解pH為 6.5，酶解時間為 2 h，料液比：1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30。

1.3.4 復(fù)合酶酶解燕麥工藝優(yōu)化試驗

在單因素實驗基礎(chǔ)上，選擇影響顯著的單因素pH、溫度、料液比和時間為自變量，β-葡聚糖含量和游離酚含量計算得到的模糊評判值為響應(yīng)值，設(shè)計響應(yīng)面分析實驗。其因素水平編碼表見表1。

1.3.5 計算模糊綜合評判值Y的方法

參考李楊等[15]人方法。采用模糊綜合評判法對燕麥復(fù)合酶酶解工藝進(jìn)行雙指標(biāo)綜合評判，評價因素集U={β-葡聚糖含量、游離酚含量}={Z1、Z2}，評價函數(shù)為Y。

Z1、Z2的函數(shù)關(guān)系如下：

將實驗數(shù)據(jù)帶入相應(yīng)的評價函數(shù)，得到評價矩陣，評價函數(shù)Y為：

注：Y2-模糊評價結(jié)果；γj-權(quán)重系數(shù)；i=1，2，3…，j-權(quán)重編號，j=1，2。

綜合考慮實驗指標(biāo)的重要程度，分配權(quán)重選取為γ={0.50,0.50}，即γ1表示游離酚含量權(quán)重系數(shù)，γ1=0.50，γ2表示β-葡聚糖含量權(quán)重系數(shù)，γ2=0.50。

1.3.6 測定方法

1.3.6.1β-葡聚糖含量測定

參考張娟等[16]人的方法并稍做改動。稱取1 g燕麥+10 mL蒸餾水→攪拌均勻→70 ℃水浴 30 min→5000 r離心5 min→取上清液1 mL+1 mL蒸餾水+4 mL剛果紅溶液→室溫下反應(yīng)10 min。蒸餾水做空白對照，配制不同濃度梯度的β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定重復(fù)3次。剛果紅溶液的配制方法：稱取0.02 g剛果紅并溶解于0.1 mol/L的磷酸緩沖液中（pH=8），定容至200 mL。

1.3.6.2 游離態(tài)含量測定

參考Xu等人[17]的方法并稍做改動。準(zhǔn)確稱取50 g酶解液，5000 r/min離心10 min，取上清定容至50 mL，然后用6 mol/L鹽酸調(diào)pH至3.0，上清液用乙酸乙酯萃?。?∶2，V/V），合并5次乙酸乙酯萃取相，在45 ℃條件下旋蒸至干，用超純水溶解殘余物，定容至10 mL。取0.125 mL游離酚提取液裝入10 mL試管中，加入福林酚試劑0.125 mL和蒸餾水0.5 mL，混勻后在室溫下靜置反應(yīng)6 min，之后加蒸餾水1 mL和7%（m/V）Na2CO3溶液1.25 mL，混勻后室溫避光靜置反應(yīng)90 min，760 nm處測定吸光值。采用不同濃度梯度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，重復(fù)測定3次。總酚含量以每100 g燕麥（干基）中所含沒食子酸當(dāng)量（mg gallic acid equivalents/100 g dry weight）表示，簡寫為mg GAE/100 g DW。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 19軟件檢驗分析比較實驗各組間均值差異顯著性（p＜0.05），響應(yīng)面試驗采用Design expert軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同前處理對燕麥中可溶性β-葡聚糖含量的影響

圖1 不同前處理工藝對燕麥中β-葡聚糖含量的影響Fig.1 The effect of different pretreatment methods on the contents of β-glucan in oat

由圖1可以看出，空白組燕麥的可溶性β-葡聚糖含量為1.23±0.02 mg/g DW，經(jīng)四種前處理后均顯著提高可溶性β-葡聚糖含量（p＜0.05）。其中，高溫α-淀粉酶耦合擠壓膨化效果最好，燕麥中可溶性β-葡聚糖含量增加 83.73%；超微粉碎處理增長最低為21.13%。四種前處理方式效果顯著大小順序為：高溫α-淀粉酶耦合擠壓膨化＞擠壓膨化＞烘烤＞超微粉碎。

2.2 不同酶處理對燕麥中β-葡聚糖和游離酚含量的影響

圖2 不同酶處理對燕麥中β-葡聚糖含量和游離酚含量的影響Fig.2 The effect of different enzymes on the contents of β-glucan and free phenolics

由圖2可以看出，隨著中性蛋白酶的增加，燕麥中β-葡聚糖含量和游離酚含量都逐漸增加，添加量增加至0.4%維持穩(wěn)定；中溫α-淀粉酶增加時，游離酚含量逐漸增加，添加量至0.2%以后維持穩(wěn)定，β-葡聚糖含量并無顯著性變化，綜合模糊評判值呈上升趨勢。添加酸性蛋白酶后β-葡聚糖含量和游離酚含量并無顯著性變化；纖維素酶添加量的增加時燕麥中β-葡聚糖含量呈下降趨勢，綜合模糊評判值呈持續(xù)下降趨勢。

2.3 復(fù)合酶解條件對燕麥中β-葡聚糖含量和游離酚含量的影響

由圖3可知，隨著酶解溫度的提高，β-葡聚糖含量呈先增加后降低的趨勢；游離酚含量在低溫時穩(wěn)定，55 ℃后開始下降。溫度為50 ℃時，其模糊評判值最高為89.07，因此最適酶解溫度為50 ℃。在pH為6.5時，其模糊評判值最高為85.63，最適pH值為6.5。

圖3 燕麥復(fù)合酶解條件對β-葡聚糖含量和游離酚含量的影響Fig.3 Effects of compound enzymolysis conditions on theβ-glucan and free phenolics in oat

酶解時間延長后，β-葡聚糖含量和游離酚含量均逐漸增加，2 h時β-葡聚糖含量和游離酚含量最高并保持穩(wěn)定，模糊評判值為88.86，因此最適酶解時間為2 h。綜合模糊評判值隨加水比例的增加，呈先增加后降低的趨勢，在料液比為1∶10時，其模糊評判值最高為88.26，因此最適料比為1∶10。

2.4 燕麥復(fù)合酶解工藝響應(yīng)面優(yōu)化

2.4.1 優(yōu)化方案與結(jié)果

X1、X2、X3和X4分別表示pH、溫度、料液比和時間，并以-1、0、+1代表各個因素的高、中、低水平。以β-葡聚糖含量和游離酚含量計算得到的模糊評判值作為響應(yīng)值Y。因素水平編碼表見表1，實驗方案及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面設(shè)計中的實驗因素和編碼水平Table 1 Experimental factors and coding levels in response surface design

表2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗方案與結(jié)果Table 2 The scheme and result of response surface optimization experiment

23 0 1 0 1 2.95 561.90 76.91 24 0 1 1 0 2.93 595.00 78.99 25 0 -1 0 1 3.04 606.67 83.21 25 0 -1 0 1 3.04 606.67 83.21 26 1 -1 0 0 2.86 565.95 76.08 27 0 0 0 0 3.37 623.57 86.47 28 -1 0 0 1 2.77 574.05 75.54 29 -1 0 -1 0 2.49 590.71 73.24

2.4.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

通過響應(yīng)面設(shè)計軟件design expert 8.06進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型：

注：X1、X2、X3、X4-因素水平編碼值；Y-模糊評判值。

回歸與方差分析結(jié)果見表 3。從表中可以看出，回歸模型p＜0.0001，說明回歸模型達(dá)到極顯著水平；失擬項p=0.1902＞0.05，說明該模型是合適的。相關(guān)系數(shù) R2=0.9415，說明該二次回歸方程能夠很好地擬合各因素與模糊評判值之間的關(guān)系，可利用該回歸方程確定復(fù)合酶解燕麥的最佳工藝。對各項F值檢驗可知，pH、溫度、時間和料液比及其二次項均為顯著影響因素（p＜0.05），溫度與時間交互項和pH與料液比交互相p＜0.01，為極顯著影響因素（圖4和圖5）。四個因素的貢獻(xiàn)率順序為：pH＞料液比＞溫度＞時間。

各因子臨界優(yōu)化結(jié)果見表 4，將臨界值優(yōu)化結(jié)果帶入方程（3）中模糊評判值為89.74。

2.4.3 驗證試驗結(jié)果

由響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果可得知，當(dāng)pH為6.6，溫度為51 ℃，料液比為1∶8，時間為2 h時，預(yù)測模糊評判值為89.74。經(jīng)過三次驗證實驗β-葡聚糖含量為3.18±0.28 mg/g DW，游離酚含量為65.71±5.96 mg/100 g DW，模糊評判值為86.49。與預(yù)測值間相對誤差為3.58%，因此實際生產(chǎn)過程中應(yīng)用該模型進(jìn)行預(yù)測是可行的。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Results of regression and variance analysis

圖4 pH與料液比的交互作用對酶解液中β-葡聚糖含量和游離酚含量的影響Fig.4 Interaction of pH value and the solid-liquid ratio on the content of β-glucan and free phenolics in oat hydrolysate

圖5 溫度與時間的交互作用對酶解液中β-葡聚糖含量和游離酚含量的影響Fig.5 Interaction of temperature and time on the content of β-glucan and free phenolics in oat hydrolysate

表4 因子的臨界值優(yōu)化結(jié)果Table 4 Critical value optimizations for factors

3 結(jié)論

3.1 燕麥?zhǔn)且环N有食用價值和醫(yī)療價值的的作物，有著重要的生理功能。寧鴻珍等[18]研究表明，燕麥β-葡聚糖可降低血液中血脂水平，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的紊亂，減少氧自由基的生成，對于防止高脂血癥誘發(fā)的動脈粥樣硬化病變具有重要的意義。

3.2 目前，我國大部分燕麥主要被加工成為燕麥粉、燕麥片、燕麥飲料以及燕麥餅干，通過不同的加工方式和酶解方法提高燕麥營養(yǎng)成分含量和改善燕麥理化特性。汪麗萍等[19]研究發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶酶解燕麥后的漿中糖組分以葡萄糖和麥芽低聚糖為主，糖化酶酶解的燕麥漿中糖組分幾乎全部為葡萄糖，α-淀粉酶酶解的漿液酶解效果和穩(wěn)定性均優(yōu)于使用糖化酶的漿液。王金華等[20]人發(fā)現(xiàn)擠壓膨化處理后大麥麩皮中可溶性β-葡聚糖提高28.35%。本研究結(jié)果表明，燕麥經(jīng)烘烤、擠壓膨化、α-高溫淀粉酶耦合擠壓膨化和超微粉碎處理均能顯著提高可溶性β-葡聚糖含量。有文獻(xiàn)報道，燕麥中存在內(nèi)源β-葡聚糖酶（如內(nèi)切β-1,3-葡萄糖酶等），能使β-葡聚糖在提取時被降解[21]。烘烤和擠壓膨化處理由于高溫使內(nèi)源β-葡聚糖酶失活，從而提高可溶性β-葡聚糖的含量。

3.3 為解決高營養(yǎng)燕麥溶解后濃漿粘稠度高，不利于燕麥飲料營養(yǎng)價值最大化和口感舒適，本研究從中性蛋白酶、酸性蛋白酶、中溫α-淀粉酶、纖維素酶四種酶比較酶解燕麥效果，結(jié)果表明，中性蛋白酶能顯著提高燕麥中可溶性β-葡聚糖含量（p＜0.05）。其原因可能在于中性蛋白酶的作用下，蛋白質(zhì)分解使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞，釋放出可溶性的膳食纖維。申瑞玲[22]等人通過在乙醇中加入蛋白酶來提高燕麥β-葡聚糖的提取率，發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖的提取率隨蛋白酶添加量的增加而增加，這與本研究結(jié)果一致。

3.4 燕麥具有抗氧化和抗炎癥的生理功能。近年來研究報道燕麥可降低患冠心病、糖尿病和癌癥的風(fēng)險[23,24]。其主要功能成分除具有豐富的β-葡聚糖外，還富含酚類抗氧化物，如以游離態(tài)或結(jié)合態(tài)存在的阿魏酸、咖啡酸、香豆酸和香草醛等[25]。武嬌等[26]研究發(fā)現(xiàn)利用微波加熱提取可以顯著提高燕麥麩皮中的總多酚的提取效率，提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性。本研究結(jié)果表明，隨中溫α-淀粉酶和纖維素酶添加量的增加其游離酚含量顯著提高(p＜0.05)。馬永強(qiáng)[27]等人利用纖維素酶酶解藍(lán)莓果漿，酶解后發(fā)現(xiàn)花色苷的含量提高2.17倍，總酚含量提高1.95倍。其原因可能在于纖維素酶和中溫α-淀粉酶對燕麥細(xì)胞壁上的纖維素和淀粉進(jìn)行了水解，進(jìn)而釋放出結(jié)合的酚類物質(zhì)。因此，纖維素酶和中溫α-淀粉酶酶解燕麥后，燕麥中游離酚含量上升。

3.5 本研究采用可溶性β-葡聚糖含量和游離酚含量為綜合指標(biāo)建立模糊綜合評判模型，優(yōu)化確定了燕麥經(jīng)擠壓膨化耦合α-高溫淀粉酶前處理，再經(jīng)中性蛋白酶和中溫α-淀粉酶（2∶1）復(fù)合酶解的工藝條件。在此條件下燕麥中可溶性β-葡聚糖含量為3.18±0.28 mg/g DW，游離酚含量為65.71±5.96 mg/100 g DW，本研究可以為開發(fā)高營養(yǎng)全谷物燕麥濃漿飲料提供指導(dǎo)。