高濃度二氧化碳?xì)庹{(diào)包裝通過(guò)調(diào)節(jié)酚代謝抑制鮮切蓮藕的酶促褐變

謝君，代鈺，王宏勛,3，易陽(yáng),3，侯溫甫,3，艾有偉，閔婷

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430023）（2.武漢食品化妝品檢驗(yàn)所，湖北武漢 430023）（3.湖北省生鮮食品工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430023）

蓮藕（NelumbonuciferaG.）廣泛種植在中國(guó)，是全球最受歡迎的蔬菜之一[1~3]。近來(lái)，隨著消費(fèi)者生活方式的改變，鮮切蓮藕作為新型加工蔬菜受到越來(lái)越多的關(guān)注[4,5]。然而，鮮切產(chǎn)品質(zhì)量下降的主要挑戰(zhàn)是酶促褐變，酶促褐變會(huì)影響感官和質(zhì)量，并限制了鮮切蓮藕的保質(zhì)期[6~8]。因此，了解如何延緩和防止酶促褐變是延長(zhǎng)鮮切蓮藕貯藏壽命的重要途徑。

目前延緩鮮切果蔬褐變方法報(bào)道很多，包括化學(xué)處理，如有機(jī)酸[9,10]，亞硫酸鹽[11]，過(guò)氧化氫[12]和電解水[13]，24-表油菜素內(nèi)酯[14]和物理處理，如氣調(diào)包裝[15]，熱處理[16]和低溫儲(chǔ)藏等[17]。其中氣調(diào)包裝在保持果蔬天然質(zhì)量和延長(zhǎng)保質(zhì)期效果明顯[18~21]，特別是高濃度的CO2MAP[8,22]。據(jù)報(bào)道，100% CO2MAP結(jié)合抗褐變處理和熱處理延長(zhǎng)鮮切蓮藕保質(zhì)期效果良好[8]。邢等[23]的研究結(jié)果表明，化學(xué)浸漬，肉桂油熏蒸和中度真空包裝顯著降低了鮮切蓮藕褐變。

蓮藕的褐變誘因主要表現(xiàn)為酶促褐變[24]。其中PAL是苯丙烷類物質(zhì)代謝中第一個(gè)關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)合成酚類、木質(zhì)素和花青素的前體物質(zhì)，其中形成的酚為果蔬酶促褐變反應(yīng)提供底物[25]，PAL基因參與鮮切果蔬的褐變已有報(bào)道。PPO是植物體內(nèi)普遍存在的一種氧化還原酶，是引起果蔬酶促褐變最關(guān)鍵的酚酶之一[26]，PPO作為果蔬酶促褐變最關(guān)鍵基因已在較多果蔬中被分離鑒定，包括甘薯和荔枝等。POD是廣泛存在于植物中的一種氧化還原酶，在H2O2存在的情況下，能將酚類物質(zhì)和類黃酮氧化聚合形成褐色物質(zhì)參與果蔬酶促褐變[27]。Xu等研究發(fā)現(xiàn)蝴蝶蘭中PhPOD基因上調(diào)是導(dǎo)致其組織培養(yǎng)中外植體褐變的主要原因[28]。由此可見，PAL、PPO和POD可能在果蔬褐變中起著重要作用。

前人研究報(bào)道了PAL，PPO和POD基因參與果蔬褐變[15,29]。我們前期研究結(jié)果表明NnPAL1，NnPPOA，NnPOD1-6是高溫誘導(dǎo)下鮮切蓮藕褐變的候選基因[17]。然而，高濃度CO2MAP對(duì)鮮切蓮藕PAL，PPO和POD酶及其編碼基因的影響鮮有報(bào)道。為了進(jìn)一步闡明高濃度CO2MAP抑制鮮切蓮藕酶促褐變的機(jī)理，本研究采用高濃度CO2MAP對(duì)鮮切蓮藕在貯藏過(guò)程中褐變度，總酚含量，PAL，PPO和POD酶活性及基因進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮蓮藕（鄂蓮五號(hào)），采于武漢漢口北四季美農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場(chǎng)。

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙醇、福林酚、無(wú)水碳酸鈉、沒食子酸、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、H2O2、聚乙二醇6000、聚乙烯吡咯烷酮，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Trition X-100，biosharp生物科技有限公司；苯丙氨酸解氨酶測(cè)定試劑盒，南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CP214（C）型電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；V-1100D紫外分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司；GL-20G-Ⅱ離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；IMS-20雪科制冰機(jī)，常熟市雪科電器有限公司；XHF-D高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；DHG-9123A電熱鼓風(fēng)干燥箱、DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海恒一科學(xué)儀器有限公司；HYC-326A醫(yī)用冷藏箱，青島海爾特種電器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；A360型紫外可見分光光度計(jì)，翱藝儀器（上海）有限公司；氣調(diào)包裝機(jī)成套設(shè)備，上海福帝包裝機(jī)械有限公司；FHW-450型保鮮膜封接機(jī)，浙江江南實(shí)業(yè)有限公司；MIR-154型低溫貯藏箱，日本三洋。DYCP-31DN電泳儀，北京市六一儀器廠；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化；T100 TM Thermal Cycler PCR儀，美國(guó)伯樂；CFX96熒光PCR儀，美國(guó)伯樂；凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)伯樂。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

蓮藕（鄂蓮五號(hào)）從商業(yè)池塘（漢口北，武漢）購(gòu)買，然后運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。蓮藕的尺寸和地面顏色均勻，并且沒有缺陷和機(jī)械損傷。處理前，蓮藕在4 ℃保存24 h。用自來(lái)水沖洗蓮藕以除去土壤并去皮。然后使用鋒利的不銹鋼刀將它們沿著蓮藕的橫截面切成5 mm厚的切片。轉(zhuǎn)入清水中浸泡2 min后，將這些鮮切蓮藕切片用濾紙吸干水分，進(jìn)行不同 MAP（100%CO2和空氣），每盒兩片，分別轉(zhuǎn)入冰箱（4 ℃，20 ℃）中。

所有處理均進(jìn)行三次重復(fù)。樣品在液氮中冷凍，儲(chǔ)存于-80 ℃進(jìn)一步使用。

1.3.2 褐變度的測(cè)定

參考以前的文獻(xiàn)測(cè)定褐變度[17]，4 ℃下，用30 mL蒸餾水將3.0 g肉組織勻漿，在4 ℃下以10,000 g離心5 min。收集上清液，在25 ℃水浴中保溫5 min。使用分光光度計(jì)在 410 nm測(cè)量吸光度，褐變度表示為A410×10。

《論語(yǔ)》中的恕和忠關(guān)系緊密，常以忠恕并提或并列。忠恕的目的是仁，是仁的內(nèi)容，行恕的目的是體現(xiàn)忠?！墩撜Z(yǔ)》指出：“子曰：‘參乎！吾道一以貫之’。曾子曰：‘唯’。子出，門人問(wèn)曰：‘何謂也？’曾子曰：‘夫子之道忠恕而已矣’?！逼湟馐侵?，孔子講：“曾參呀！我的學(xué)說(shuō)貫穿著一個(gè)基本思想?！痹诱f(shuō)：“是的?！笨鬃幼吡顺鋈?，別的學(xué)生問(wèn)道：“這是什么意思呢？”曾子說(shuō)：“先生的學(xué)說(shuō)就是忠和恕罷了?！焙芮宄?，忠恕已成為《論語(yǔ)》道德準(zhǔn)則的核心內(nèi)容。

1.3.3 總酚含量的測(cè)定

參考以前的文獻(xiàn)測(cè)定總酚含量[17]，將3.0 g新鮮的肉組織樣品用30 mL的60%乙醇勻漿，并以10,000 r/min離心5 min。將上清液（10 mL）用40 mL 60%乙醇稀釋以進(jìn)行下一次測(cè)量。將0.125 mL溶液和0.625 mL蒸餾水混合，然后加入0.125 mL福林酚試劑。充分混合后，將混合物在室溫下靜置3 min，然后加1.25 mL 7%NaCO3和1.0 mL蒸餾水H2O。在25 ℃水浴中避光靜置90 min后，使用分光光度計(jì)測(cè)量在760 nm處的吸光度。使用沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)量化總酚含量。結(jié)果表示為沒食子酸當(dāng)量/kg鮮重（mg/kg）。

1.3.4 PAL、PPO和POD酶活性的測(cè)定

PAL、PPO和POD酶的提取和活性測(cè)定按照以前的文獻(xiàn)所述進(jìn)行[17]。通過(guò)分光光度法將PAL酶活性單位（U）定義為每克鮮重每分鐘吸光度值在290 nm變化0.1所需的酶量。一個(gè)單位（U）的PPO活性被定義為在420 nm處每分鐘引起吸光度改變0.001所需的酶量。用分光光度法將POD酶活性單位（U）定義為在470 nm每分鐘引起吸光度改變0.01所需的酶量。

1.3.5 RNA提取和CDNA合成

根據(jù)以前的文獻(xiàn)制備總 RNA。TURBO Dnase（Ambion）被用于去除總RNA中污染的基因組DNA的痕跡。用iScript cDNA合成試劑盒（Bio-Rad）進(jìn)行cDNA合成[30]。

1.3.6 實(shí)時(shí)定量PCR

Min等文獻(xiàn)描述了用于 PCR分析的寡核苷酸引物。根據(jù)以前的文獻(xiàn)使用SsofastEvaGreenSupermix試劑盒（Bio-Rad）和CFX96熒光PCR進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR以進(jìn)行基因表達(dá)研究[17]。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 8.0軟件繪制圖片；使用DPS7.05軟件進(jìn)行最小顯著性差異（LSD）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐變度

不同的MAP（100% CO2和空氣）用于鮮切蓮藕切片貯藏研究。研究結(jié)果表明兩種MAP在整個(gè)儲(chǔ)存期間促進(jìn)了不同程度的褐變(圖1)。相比于對(duì)照，100%CO2MAP鮮切蓮藕的褐變明顯延緩，褐變度（BD）僅從0.260增加到0.346，而在貯藏35 d后的空氣對(duì)照中，褐變程度（BD）到0.460。

BD作為果蔬褐變的主要指標(biāo)用于評(píng)價(jià)其褐變情況。通過(guò)測(cè)定褐變度發(fā)現(xiàn)100%CO2MAP的褐變度值明顯低于對(duì)照。因此，這一結(jié)果進(jìn)一步證明了高濃度CO2能有效延緩鮮切蓮藕褐變進(jìn)程[8]。

圖1 不同氣調(diào)包裝4 ℃貯藏鮮切蓮藕褐變度Fig.1 BD value of modified atmosphere packaging fresh-cut lotus roots in 4 ℃

2.2 總酚含量

圖2 不同氣調(diào)包裝4 ℃貯藏鮮切蓮藕總酚含量Fig.2 Total phenol content of modified atmosphere packaging fresh-cut lotus roots in 4 ℃

如圖2所示不同的MAP對(duì)貯藏期間鮮切蓮藕總酚含量的影響明顯不同。100%CO2MAP的樣品中總酚含量沒有明顯變化，從第0 d的69.491 mg/kg到第35 d的67.101 mg/kg。但是空氣組增長(zhǎng)較快，從第0 d的69.491 mg/kg增加到第35 d的84.050 mg/kg。結(jié)果表明，高濃度的CO2MAP在貯藏期間延緩了總酚含量的增加，這與前期研究結(jié)果相一致[17]。

2.3 PAL、PPO和POD活性

如圖3所示，貯藏期間兩種不同MAP對(duì)PAL、PPO和 POD酶活性的影響均明顯不同。兩種不同MAP樣品的PAL活性顯示出不同程度的增加，從初始值為 5.363 U/g至第 35 d分別為 100%CO2組的11.418 U/g和空氣組的 17.473 U/g。其中100%CO2MAP的樣品PAL活性顯示較慢的增長(zhǎng)。

圖3 不同氣調(diào)包裝4 ℃貯藏鮮切蓮藕PAL、PPO和POD酶活性Fig.3 PAL, PPO and POD avtivity of modified atmosphere packaging fresh-cut lotus roots in 4 ℃

與PAL類似，兩種不同MAP中樣品的PPO活性顯示不同程度的增加，從初始值為0.611 U/g至第35 d分別為 100%CO2組的 0.833 U/g和空氣組的 1.311 U/g。在整個(gè)貯藏期間，100%CO2組樣品的PPO活性增加緩慢。100%CO2樣品的POD活性顯示出輕微的變化，并保持較低的值，從第0 d的0.034 U/g到第35 d的0.078 U/g。然而，空氣組中的POD活性迅速增加，從0.034 U/g至第35 d的0.144 U/g。與空氣組對(duì)比，在整個(gè)貯藏期間，100% CO2組樣品的POD活性增加較為緩慢。

前人研究報(bào)道了PAL，PPO和POD參與了鮮切蓮藕的酶促褐變[18,31]。通過(guò)分析兩種不同 MAP條件下PAL，PPO和POD酶活性的變化。結(jié)果表明在100%CO2組的樣品中，PAL，PPO和POD活性的與貯藏過(guò)程中鮮切蓮藕的褐變程度相一致，這一結(jié)果與前人報(bào)道相一致[32~34]。然而，也有一些不同的觀點(diǎn)，Gao等[5]人發(fā)現(xiàn)100% O2處理的鮮切蓮藕，其PPO活性最低，其褐變抑制效果最好，這可能是由于品種的差異所致。

2.4 NnPAL、NnPPO和NnPOD基因表達(dá)

圖4 不同氣調(diào)包裝4 ℃貯藏鮮切蓮藕中NnPAL、NnPPO、NnPOD基因表達(dá)分析Fig.4 NnPAL, NnPPO and NnPOD expression patterns in response to different modified atmosphere packaging in fresh-cut lotus root

如圖4所示，2個(gè)NnPAL基因?qū)蓚€(gè)不同的MAP響應(yīng)不一樣。NnPAL1的表達(dá)對(duì)氣調(diào)包裝特別敏感，在整個(gè)貯藏過(guò)程中，空氣組被不斷誘導(dǎo)，在35 d達(dá)到峰值，但100%CO2組在第21 d開始下調(diào)。NnPAL2的表達(dá)較為恒定，表達(dá)量較低。

NnPPO基因表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式?？諝獍b的鮮切蓮藕的NnPPOA基因在整個(gè)貯藏期間被持續(xù)誘導(dǎo)，但是在貯藏后期100%CO2組的NnPPOA的表達(dá)下調(diào)。然而，在兩種不同MAP之間的NnPPOC表達(dá)沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異。

在NnPOD基因家族中，與對(duì)照相比，NnPOD2和NnPOD3的表達(dá)分別下降了30多倍和280倍，并且與酶活性的變化相一致。在兩種不同的MAP樣品中NnPOD1和NnPOD4的表達(dá)均呈不同程度增加，其表達(dá)水平相對(duì)低于NnPOD2和NnPOD3。相比之下，100% CO2組在整個(gè)貯藏過(guò)程中NnPOD5和NnPOD6被持續(xù)誘導(dǎo)。與其他NnPOD基因不同，NnPOD7的表達(dá)無(wú)顯著變化。

前期研究發(fā)現(xiàn)NnPAL，NnPPO和NnPOD參與蓮藕的褐變[17]。本研究發(fā)現(xiàn) 100%CO2包裝的鮮切蓮藕的NnPAL1，NnPPOA和NnPOD2/3比其他基因家族成員下調(diào)更明顯。據(jù)報(bào)道蘋果和PbPAL1，PbPAL2和PbPPO1的梨中Md-PPO參與了組織褐變，其表達(dá)模式與高濃度 CO2MAP的表達(dá)模式相似[15,35]。此外，NnPAL1，NnPPOA和NnPOD2/3的表達(dá)變化與PAL，PPO和POD酶活性的變化并行發(fā)生。然而，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)在高溫下NnPAL1，NnPPOA和NnPOD1-6的上調(diào)與新鮮蓮藕褐變度的增加相一致[17]。綜合前期報(bào)道和目前結(jié)果，NnPAL1，NnPPOA和NnPOD2/3被認(rèn)為是鮮切蓮藕褐變的重要候選基因，有待進(jìn)一步的功能分析。

3 結(jié)論

綜上所述，本研究分析了兩種不同MAP對(duì)鮮切蓮藕的褐變度，總酚含量，PAL，PPO和POD酶活性及其編碼基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，100%CO2MAP對(duì)延緩鮮切蓮藕褐變效果明顯。PAL，PPO和POD酶活性的變化與 100%CO2MAP貯藏的褐變程度相一致。此外，NnPAL1，NnPPOA和NnPOD2/3的表達(dá)變化與PAL，PPO和POD酶活性的變化以及褐變度相一致，說(shuō)明高濃度CO2MAP可能通過(guò)下調(diào)NnPAL1，NnPPOA和NnPOD2/3的表達(dá)延緩鮮切蓮藕褐變進(jìn)程。