貴州小關(guān)山銀花的成分鑒定及其功效成分的分布規(guī)律

賈強，江津津，張越華，白楊，王英，張挺，黎揚慶，黃世希，薛志平，高求忠

（1.廣州城市職業(yè)學(xué)院食品系，廣東廣州 510404）（2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510275）

山銀花(Lonicera hypoglauca)為灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬或黃褐毛忍冬的干燥花蕾或初開的花的統(tǒng)稱，是我國常用的中藥材之一，中醫(yī)證實其具清熱解毒等功效，可用于治療急性口腔炎、肝損傷、風(fēng)熱感冒、瘟病發(fā)熱、熱毒血痢和喉痹丹毒等病癥[1～4]，也具有抗氧化、抗病原微生物、抗腫瘤、抗過敏、降血脂、抗動脈粥樣硬化、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[5,6]，是犀羚解毒丸(Pc)、Vc銀翹片和銀翹解毒片等多種中成藥的主要原料，還廣泛應(yīng)用于飲料、食品、保健品和化妝品等方面。山銀花在我國四川、廣東、廣西、湖南、貴州、云南、安徽、浙江和海南等省均有分布[7]，其化學(xué)成分包括有機酸、黃酮、萜皂苷、環(huán)烯醚萜、揮發(fā)油及微量元素等[8～17]。金銀花又名忍冬（Lonicera japonica），與山銀花同屬忍冬科，形狀特征和藥理作用有相似。山銀花因盛產(chǎn)在我國南方而曾被稱為南方金銀花，2005年，《中華人民共和國藥典》把金銀花和山銀花分開單列，導(dǎo)致人們對山銀花的功效產(chǎn)生疑慮，對我國南方的山銀花產(chǎn)業(yè)造成了不良影響。2015年，國家藥典委仍將金銀花和山銀花單列，但建議加大對山銀花成分、藥性等方面的研究[1]。本研究團隊對同一產(chǎn)地不同部位、不同花期的山銀花植株進行采集，采用 UPLC-QTOF-MS/MS進行分析，一方面探究山銀花主要功效成分，為山銀花的生理活性研究提供方法，另一方面研究其在一個生長周期內(nèi)主要功效成分的積累與分布規(guī)律，以確定適宜采收期，為我國南方山銀花的規(guī)范化栽培和采收提供理論依據(jù)。本研究采用的超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間-質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-QTOF-MS/MS）能極大限度的保留樣品的原始成分，而且樣品前處理相對簡易，分辨率高并能夠提供母離子和碎片離子的精確質(zhì)量，還能同時實現(xiàn)定性定量分析和快速全面的成分檢測，尤其適合一般方法難以檢測的水溶性成分。

1 材料與方法

1.1 原料

以貴州綏陽小關(guān)山銀花不同時期的植株以及植株的不同部位為樣本，所采樣本為忍冬科植物灰氈毛忍冬Loniceramacranthoides Hand.-Mazz.。具體采集方案及處理方法見表1。

表1 山銀花樣品的采集表Table 1 Collection of samples of Loniceramacranthoides Hand.-Mazz.

1.2 主要儀器設(shè)備

Ultimate 3000 DGLC高效液相色譜儀，美國Dionex公司；DGP-3600SD雙三元泵、SRD-3600脫氣機、WPS-3000SL自動進樣器、TCC3000-RS柱溫箱、DAD檢測器、Chromeleon6.8數(shù)據(jù)處理軟件；超快速高效液相色譜儀(LC-20AD-XR二元泵、SIL-20AD-XR自動進樣器、CTO-20A柱溫箱、SPD-M20A PDA檢測器)，日本島津公司；四級桿-飛行時間質(zhì)譜儀(QTOF 5600 plus)，美國AB SCIEX公司；色譜柱：Dionex Acclaim? PolarAdvantageⅡ C18 (3 μm，150 mm×4.6 mm)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-250DE型)，昆山超聲儀器有限公司；系列精密移液器，德國Eppendorf公司；十萬分之一電子分析天平(BP211D型)，德國Sartorius公司；超純水器(Simplicity)，美國Millipore公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(4001型)，德國Laborota公司；烘箱(UFB400型)德國Memmert公司；乙腈(質(zhì)譜純)，美國 Fisher Scientific公司；甲酸(批號：0001408600)，Sigma公司；乙醇(食用級)，廣州東征玻璃化學(xué)儀器公司；標準對照品(見表2)。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液制備

各稱取10 mg的標準對照品用80%色譜級甲醇溶解定容至10 mL容量瓶；各取20 μL上述單一對照品溶液混合，用80%甲醇定容至2 mL，備用。

表2 標準對照品列表Table 2 List of standards

1.3.2 樣品供試液制備

取山銀花樣品粉末，過4號篩，精密稱取0.5 g，加80%甲醇50 mL并超聲（功率300 W，頻率40 kHz）40 min，過濾，濾液濃縮，用80%甲醇定容至10 mL，沉淀過夜，取1 mL上清用0.22 μm微孔濾膜濾過，備用。

1.3.3 分析條件

色譜條件：色譜柱為Dionex Bonded Silica C18(4.6 mm×150 mm，3 μm)；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液，按表3所示梯度洗脫；流速為 0.3 mL/min；柱溫為25 ℃；進樣量為 3 μL。

表3 流動相梯度洗脫條件Table 3 Gradient elution conditions of mobile phase

質(zhì)譜條件：離子噴霧電壓ion spray voltage 5500 V；離子源氣體1 ion source gas1155 psi；離子源氣體2 ion source gas 2255 psi；溫度temperature 550 ℃；氣簾氣 curtain gas 35 psi；碰撞氣體壓力 collision gas pressure 10 psi；離子源：ESI源，分別采用正、負離子模式進行檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 山銀花提取物UPLC-QTOF-MS/MS成分分析

在 1.3.3所述的 UPLC-QTOF-MS/MS分析條件下，分別在正負模式下對山銀花樣品同時進行一級和二級掃描得到正、負模式總離子流圖，如圖1所示。對離子流成分分析及其歸屬進行分析。

經(jīng)過與標準譜圖庫對照、準確分子量對照和裂解碎片質(zhì)譜圖人工解析，再用對照品的裂解碎片質(zhì)譜圖進行比較驗證，初步鑒定出貴州小關(guān)山銀花提取物中的40個化合物，并按色譜峰面積歸一法計算各組分的相對百分含量。質(zhì)譜碎片及化合物鑒定結(jié)果見表4。

圖1 山銀花提取物的正模式（a）及負模式（b）總離子流圖Fig.1 The positive mode (a) and negative mode (b) total ion flow diagram of the extract of Lonicera hypoglauca

2.2 山銀花中功效成分在不同花期、不同部位的變化規(guī)律

楊瓊等研究者在 2013年對貴州產(chǎn)山銀花的功效成分與花期氣候因子的相關(guān)性進行了探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的山銀花中的功效成分含量差異較大?；ㄆ跉夂蛞蜃樱ㄈ照?、濕度、降雨量和氣溫）對山銀花的有效成分積累的影響較大，建議根據(jù)不同的目標選擇適宜區(qū)域種植山銀花[18]。本研究UPLC-QTOF- MS/MS方法，根據(jù)各個功效成分離子流響應(yīng)值分析同一產(chǎn)地， 不同花期和植株不同部位的功效成分分布規(guī)律。

表4 貴州綏陽小關(guān)山銀花中的化合物Table 4 Compounds detected in Lonicera hypoglauca in Suiyang Xiaoguan, Guizhou

2.2.1 花蕾期花和盛花期花中成分的比較

圖2 功效成分在花蕾期和盛花期花序的正離子峰面積Fig.2 Composition of positive ion peaks area in the flower bud and flowering parts

圖3 功效成分在花蕾期和盛花期的花序的負離子峰面積Fig.3 Composition of negative ion peaks area in the flower bud and flowering parts

不同花期的花都含有綠原酸、新綠原酸和隱綠原酸、木犀草苷、川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷乙、木犀草素、二咖啡酰奎尼酸、槲皮苷、槲皮素、蘆丁等成分，如圖2和圖3所示。從化合物組成來看，沒有明顯差異；但從含量來看，大部分化合物在花蕾期花中的含量高于盛花期的花，例如綠原酸類、蘆丁、山萘黃甙、二咖啡?？崴?、灰氈毛忍冬皂苷乙等化合物，而盛花期花中含量高于花蕾期的化合物主要是川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬次皂苷乙、灰氈毛忍冬皂苷甲以及苜蓿素等部分化合物。因此，需要利用綠原酸類化合物、灰氈毛忍冬皂苷乙的可在花蕾期采收，需要利用川續(xù)斷皂苷乙和灰氈毛忍冬甲等成分的可等到盛花期再采收。

2.2.2 花蕾期葉和盛花期葉中成分的比較

花蕾期葉中，除蘆丁等小部分化合物外，大部分其他黃酮類化合物含量低于或等于盛花期葉中含量；綠原酸類和咖啡?？崴犷惢衔锖恳驳陀谑⒒ㄆ诘?；但大部分糖苷類和皂苷類化合物在花蕾期葉的含量高于盛花期，如圖4和圖5所示。故而，山銀花的葉也可用于藥用和開發(fā)功能食品，需利用皂苷類化合物的可采收花蕾期的葉，需利用綠原酸類等化合物的可采收盛花期的葉。

圖4 功效成分在花蕾期和盛花期的葉部位的正離子峰面積Fig.4 Composition of positive ion peaks area in bud leaf and flowering leaf

圖5 功效成分在花蕾期和盛花期的葉部位的負離子峰面積Fig.5 Composition of negative ion peaks area in bud leaf and flowering leaf

2.2.3 花蕾期枝和盛花期枝中成分的比較

綠原酸類、咖啡?？崴犷惢衔?、木犀草素、灰氈毛忍冬次皂苷甲在盛花期的枝椏部位含量比花蕾期的枝中高，而多數(shù)糖苷類、黃酮類化合物在花蕾期的枝中的含量更高，結(jié)果如圖6和圖7所示。

圖7 功效成分在花蕾期和盛花期的枝部位的負離子峰面積Fig.7 Composition of negative ion peaks area in buds branches and flowering branches

2.2.4 花蕾期不同部位（花、葉、枝）中功效成分的比較

圖8 成分在花蕾期不同部位（花、葉、枝）的正離子峰面積Fig.8 Positive ion peak area of different parts (flowers, leaves and branches) in bud stage

圖9 成分在花蕾期不同部位（花、葉、枝）的負離子峰面積Fig.9 Negative ion peak area of different parts (flowers, leaves and branches) in bud stage

花蕾期的葉中蘆丁等黃酮類化合物的含量明顯高于花中的含量；葉中綠原酸類化合物的含量與花中含量接近；除木通皂苷D外，花中其它皂苷類化合物的含量均高于葉和枝中；枝中木犀草素、木犀草苷、槲皮苷、糖苷類化合物明顯高于花和葉，枝中其它大部分化合物的含量均低于花和葉的含量。總體而言，在花蕾期，花的功效成分含量均高于葉和枝，如圖8和圖9所示。因此，小關(guān)山銀花花蕾期的花和葉均適合藥用及相關(guān)功能食品的開發(fā)。

2.2.5 盛花期不同部位（花、葉、枝）中功效成分的比較

圖10 功效成分在盛花期不同部位（花、葉、枝）中的負離子峰面積Fig.10 Negative ion peak area of different parts (flowers, leaves and branches) at the flowering stage

盛花期不同部位（花、葉、枝）中的功效成分與花蕾期不同部位的功效成分結(jié)果有差異（見圖 10），盛花期葉中綠原酸類和蘆丁化合物含量明顯高于花和枝中；除木通皂苷D外，花中其它皂苷類化合物的含量均高于葉和枝中；枝中的木犀草素、糖苷類化合物、咖啡?？崴犷惢衔镆约安糠贮S酮類化合物含量明顯高于花和葉，其它大部分化合物的含量低于花和葉的含量?？傮w而言，在盛花期，花和葉中所含的功效成分含量差異大，若需要利用綠原酸類化合物，葉優(yōu)于花和枝，但若需要利用皂苷類化合物，花明顯優(yōu)于葉和枝。在貴州小關(guān)山銀花的盛花期，花和葉均可用于制藥及相關(guān)功能食品的開發(fā)。

3 結(jié)論

3.1 本文采用目前處于世界領(lǐng)先水平的UPLC-QTOF-MS/MS聯(lián)用技術(shù)對貴州綏陽小關(guān)山銀花的化學(xué)成分進行分析鑒定，確定了山銀花中的 40種成分，是目前山銀花研究報道中一次性鑒定成分較多的方法，為天然產(chǎn)物多成分分析和鑒定提供實驗方法，也為山銀花生理活性研究和綜合利用提供理論依據(jù)。

3.2 本文也對貴州綏陽小關(guān)山銀花的不同花期及不同采摘部位的成分及含量變化進行研究，探討了山銀花多種藥效成分在不同部位和不同時期的分布規(guī)律，初步確定出山銀花不同藥效成分的不同采收期，為山銀花的規(guī)范化栽培和采收提供理論依據(jù)。本文也對山銀花除了花序之外的葉和枝進行了研究，測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)很多功效成分在葉中的含量也很高，所以花和葉均可以作為藥用或者用于相關(guān)保健食品的研發(fā)。研究結(jié)果還表明，貴州小關(guān)山銀花除了含有我國藥典里寫明的三種成分即綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙外，還含有很多其他功效成分，其中，番木鱉苷A、木犀草素-7-O-蕓香糖苷、蘆丁(槲皮素-3-0-葡萄糖-(6→1)鼠李糖甙)、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、木犀草苷、二咖啡?？崴?、槲皮苷、山萘黃甙、木犀草素、苜蓿素等功效成分的相對含量較高。上述研究結(jié)果為我國南方地區(qū)山銀花的種植、推廣和進一步的開發(fā)利用以及相關(guān)保健食品的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。貴州綏陽小關(guān)山銀花的其他藥效與機理還在進一步研究之中，山銀花功效成分的進一步分離，是本研究團隊下一步工作的重點，相關(guān)研究成果也將陸續(xù)報道。