一種羧甲基茯苓多糖的結(jié)構(gòu)及生物活性

劉曉菲，胡雙飛，張學(xué)武

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

茯苓為多孔菌科真菌茯苓 Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核[1]，收載于《中國(guó)藥典》，位列中藥“四君八珍”之中，別稱玉靈、茯靈、松苓和茯菟等，具有很高的食補(bǔ)和藥用價(jià)值，具有祛濕利尿、健脾和胃及安神寧心等功效，是一種藥食兩用的傳統(tǒng)中藥材。茯苓多糖（Pachyman）為茯苓的主要有效成分，占茯苓菌核的80%以上。大量研究發(fā)現(xiàn)茯苓多糖具有多種生物活性[2～4]。茯苓多糖主要包括中性多糖和酸性多糖，其中具有水溶性的中性多糖比例極小，而含有的大量的酸性多糖為堿溶性多糖，水溶性較差，不利于人體吸收，故臨床應(yīng)用受到很大的限制。研究發(fā)現(xiàn)多糖的藥理活性與其溶解度有著密切的關(guān)系，水溶性是多糖發(fā)揮生物學(xué)活性的重要條件之一。此外，單糖組成、糖苷鍵構(gòu)型、連接方式以及分支度等結(jié)構(gòu)信息都是影響多糖生物活性的重要因素。因此對(duì)堿溶性茯苓多糖進(jìn)行化學(xué)修飾以改善其溶解性能、提升其生理功效，并研究多糖的結(jié)構(gòu)與其活性之間的構(gòu)效關(guān)系成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。茯苓多糖經(jīng)羧甲基化改性可得到水溶性羧甲基茯苓多糖（Carboxymethyl Pachmaran，CMP），具有抗腫瘤、抗炎和免疫增強(qiáng)等作用[5～7]。目前，對(duì)于茯苓多糖羧甲基化改性、純化以及評(píng)價(jià)其生物活性，并分析其構(gòu)效關(guān)系等系統(tǒng)的研究工作仍處于起步階段，尤其是對(duì)純化羧甲基茯苓多糖的抗炎作用的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)具有良好水溶性的羧甲基茯苓粗多糖進(jìn)行分離純化，表征其純化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)以及評(píng)價(jià)其抗腫瘤和抗炎活性的研究，以期深層次研究羧甲基茯苓多糖結(jié)構(gòu)與其藥效的關(guān)系及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)該多糖相關(guān)產(chǎn)品，并為將其應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健品以及化妝品化工等領(lǐng)域提供數(shù)據(jù)支持與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

羧甲基茯苓粗多糖，本實(shí)驗(yàn)室自制，羧甲基化取代度 0.52；人結(jié)腸癌細(xì)胞（HT-29）、人肝癌細(xì)胞（HepG-2）、人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）、人胃癌細(xì)胞（SGC-7901）、人肺癌細(xì)胞（A549），購(gòu)自中山大學(xué)動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室；小鼠單核巨噬細(xì)胞（RAW264.7），廣東省人民醫(yī)院饋贈(zèng)；DEAE-52纖維素、Sephadex-G200、Sephadex-G150上海源葉生物科技有限公司；Mouse TNF-α Elisa kit、Mouse IL-1β Elisa kit、Mouse IL-6 Elisa kit，欣博盛生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基，Gibco公司；McCoy’s 5A基礎(chǔ)培養(yǎng)基，杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-巖藻糖、D-葡萄糖、D-半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；其它試劑為分析純。

RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海榮生有限公司；HL-2B型恒流泵，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；DBS-100型自動(dòng)部分收集器，上海滬西分析儀器廠；Model-550酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，Bio-Rad公司；MCO-17AC CO2培養(yǎng)箱，Sanyo公司；Allegra X-22R型高速冷凍離心機(jī)，Beckman Coulter公司；UV2300紫外分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司；Nexus FT-IR紅外光譜儀，Thermo Nicolet公司；Waters Breeze GPC凝膠滲透色譜儀，美國(guó)沃特斯公司；Aglient 6890 N氣相色譜系統(tǒng)，美國(guó)安捷倫公司；600 MHz核磁共振波譜儀，Bruck公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羧甲基茯苓多糖的純化羧甲基茯苓粗多糖樣品上 DEAE-52纖維素層析柱純化，用0.2 mol/L NaCl溶液洗脫，采用苯酚-硫酸法進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，收集主要洗脫峰，真空濃縮、透析后冷凍干燥，獲得羧甲基茯苓多糖 CMP4；Sephadex-G200和Sephadex-G150層析柱進(jìn)一步純化，0.2 mol/L NaCl溶液洗脫獲得羧甲基茯苓多糖CMP44。

1.2.2 CMP44結(jié)構(gòu)鑒定

1.2.2.1 純度測(cè)定

CMP44溶于定量超純水，取1.0 mL于25 mL比色管中，補(bǔ)加超純水至2.00 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，混合搖勻后快速加入濃硫酸5.00 mL，30 min沸水浴，靜置冷卻，以不加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液比色管為空白對(duì)照，于490 nm處測(cè)其吸光度值；五個(gè)平行。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中多糖含量。

1.2.2.2 相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

GPC色譜條件：Water Breeze GPC凝膠滲透色譜儀，TOSOH公司色譜柱 TSK-GEL G-5000PWXLcolumn與TSK-GEL G-3000PWXLcolumn（7.8 mm×300 mm）串聯(lián)，柱溫：35 ℃；流動(dòng)相0.02 mol/L KH2PO4溶液，pH值6.0，流速0.6 mL/min。

GPC校正曲線方程：葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品系列分別用流動(dòng)相配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣量20 μL，采集色譜圖。

CMP44用流動(dòng)相配制成濃度為1.0 mg/mL的溶液，0.45 μm水相微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣量20 μL，采集色譜圖。

1.2.2.3 紫外光譜分析

稱取CMP44 1 mg，超純水溶解，配成1 mg/mL的樣液，以超純水為空白對(duì)照，于200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描分析。1.2.2.4 紅外光譜分析

稱取CMP44 2 mg，加入適量已干燥的KBr粉末，研磨均勻、壓片，于400～4000 cm-1區(qū)間內(nèi)進(jìn)行掃描分析。

1.2.2.5 單糖組成分析

GC色譜條件：Aglient 6890 N氣相色譜儀；DB-1701毛細(xì)管柱（30.0 m×320 μm×0.25 μm），進(jìn)樣前依次吡啶洗針3次，丙酮洗針3次；進(jìn)樣口溫度設(shè)為 250 ℃，分流比 20∶1；載氣氮?dú)?，流速?40 mL/min；氫氣流速為25 mL/min，空氣流速為450 mL/min。程序升溫：初始溫度為180 ℃，保持2 min；2 ℃/min升溫至220 ℃，保持1 min；7 ℃/min升溫至250 ℃，保持1 min；檢測(cè)器溫度250 ℃；進(jìn)樣量1.0 μL。

樣品水解：稱取CMP44 10 mg于安瓿瓶?jī)?nèi)，加入2 mol/L的三氟乙酸溶液 4 mL，用酒精噴燈封口后110 ℃水解8 h。水解液冷卻至室溫，加入適量甲醇，減壓濃縮蒸干，重復(fù)5次完全除去三氟乙酸。

單糖衍生化：水解物中加入0.5 mL吡啶和10 mg鹽酸羥胺，90 ℃水浴并振蕩反應(yīng)30 min，冷卻至室溫后加入0.5 mL醋酸酐，90 ℃繼續(xù)水浴30 min進(jìn)行乙?；幚恚粏翁菢?biāo)準(zhǔn)品采用相同操作方法進(jìn)行衍生化。

上述單糖氣相衍生物經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，按照氣相色譜條件，進(jìn)行上機(jī)分析。

1.2.2.6 高碘酸氧化和Smith降解分析

高碘酸氧化：稱取CMP44 20 mg，溶于15 mmol/L的NaIO4溶液?；靹蚝笫覝匕堤幏磻?yīng)，每間隔6 h取樣，223 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值，至值恒定后向體系中加入1.5 mL乙二醇終止反應(yīng)。根據(jù)NaIO4標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出高碘酸消耗量。將含有乙二醇的溶液放置20 min后，取2 mL，加入酚酞指示劑，已標(biāo)定的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，計(jì)算甲酸生成量。溶液剩余部分用于Smith降解反應(yīng)。

Smith降解：將乙二醇處理后的溶液進(jìn)行透析，流水、超純水各24 h。減壓濃縮后加入硼氫化鈉進(jìn)行還原，過(guò)夜。然后，用50%的醋酸調(diào)其pH值至6～7，中和剩余硼氫化鈉，流水、超純水各24 h透析。減壓濃縮至干，加入2 mol/L三氟乙酸，110 ℃封管水解反應(yīng)8 h乙?；?，GC上機(jī)分析，色譜條件同1.2.2.5。1.2.2.7 核磁共振分析

CMP44樣品15 mg溶于0.5 mL重水中，溶解后轉(zhuǎn)移至核磁管中，于600 MHz核磁共振儀上進(jìn)行氫譜(1H-NMR)和碳譜(13C-NMR)分析，采用MestReNova-11.0.2軟件對(duì)圖譜進(jìn)行分析。

1.2.2.8 三螺旋結(jié)構(gòu)分析

稱取CMP44 2 mg，加入超純水和100 μmol/L剛果紅試劑各2 mL，加入4 mol/L NaOH溶液，使溶液中堿濃度逐漸增加至0.5 mol/L，于400～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)。以不加CMP44樣品的剛果紅溶液為對(duì)照。橫坐標(biāo)NaOH濃度，縱坐標(biāo)最大吸收波長(zhǎng)繪制曲線。

1.2.3 CMP44體外抗腫瘤活性

1.2.3.1 樣品溶液配制

CMP44以DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基和McCoy’s 5A基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別配制成1000 μg/mL的多糖母液，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，兩倍稀釋至不同濃度梯度，待用。

1.2.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用DMEM高糖完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素）培養(yǎng)HepG-2、SGC-7901、MCF-7、A549細(xì)胞；McCoy’s 5A完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素）培養(yǎng)HT-29細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.3 細(xì)胞增殖測(cè)定

采用MTT比色法[8]分析CMP44對(duì)五種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞100 μL接種于96孔板，培養(yǎng)48 h。分別加入31.25～1000 μg/mL的CMP44和陽(yáng)性藥物5-氟尿嘧啶（5-Fu）溶液，每孔加入200 μL，空白培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用PBS洗板2次，加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液和180 μL相應(yīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液，培養(yǎng)4 h。取出去除含有MTT的培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO振蕩反應(yīng)15 min，490 nm處測(cè)定其吸光度值。

細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-OD給藥/OD對(duì)照)×100%

1.2.4 CMP44體外抗炎活性

1.2.4.1 樣品溶液配制

CMP44以 RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制成 1000 μg/mL的母液，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，兩倍稀釋成不同濃度，待用。1.2.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)

以RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含8%胎牛血清）培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞。

1.2.4.3 細(xì)胞毒性測(cè)定

采用MTT比色法測(cè)定CMP44對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性強(qiáng)弱，測(cè)定操作同1.2.3.3。1.2.4.4 實(shí)驗(yàn)分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞，用血球平板計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞懸液密度約為1×105個(gè)/mL，反復(fù)吹打均勻，100 μL/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，吸除培養(yǎng)液，依照以下實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行給藥處理：Control組，細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL；LPS組：LPS（終濃度1 μg/mL）細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL；LPS+CMP44樣品組：含LPS（終濃度 1 μg/mL）及 CMP44（31.25～1000 μg/mL）的細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL；CMP44樣品組：CMP44（31.25～1000 μg/mL）的細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL。每組樣本均設(shè)5個(gè)復(fù)孔。封板后培養(yǎng)24 h，收集上清液。

1.2.4.5 NO釋放量測(cè)定

CMP44對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO釋放量測(cè)定采用Griess試劑法[9]。96孔板中加入已收集的上清液取100 μL，加入等體積 Griess試劑（0.1%的1-萘乙烯二胺與溶于5%磷酸中的1%對(duì)氨基苯磺酸等體積混合），室溫下振蕩反應(yīng)10 min，540 nm處測(cè)定其吸光度值，根據(jù)NO2-標(biāo)準(zhǔn)曲線（NaNO2溶液0～200 μmol/L濃度與Griess試劑反應(yīng)，以NO2-的濃度為橫坐標(biāo)、540 nm處吸光度值為縱坐標(biāo)繪制曲線），計(jì)算細(xì)胞上清液中NO的釋放量以及CMP44對(duì)NO釋放的抑制率。

1.2.4.6 細(xì)胞因子釋放量測(cè)定

CMP44對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放IL-6、TNF-α及IL-1β測(cè)定采用ELISA酶聯(lián)免疫試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，SPSS 19.0軟件進(jìn)行one-way ANOVA分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，p＜0.05為差異顯著，p＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 羧甲基茯苓多糖柱層析分離純化

圖1 DEAE-52纖維素層析柱洗脫曲線Fig.1 Elution curve of DEAE-52 cellulose column chromatography

羧甲基茯苓粗多糖以0.2 mol/L NaCl溶液為洗脫溶液，經(jīng)DEAE-52纖維素層析柱純化，苯酚-硫酸法檢測(cè)的洗脫曲線如圖1所示。從曲線圖可見(jiàn)，洗脫峰峰形較對(duì)稱，分離效果較好。收集主要組分對(duì)應(yīng)的試管溶液，經(jīng)真空濃縮、透析、冷凍干燥后獲得組分，命名為CMP4。

圖2 Sephadex-G200和Sephadex-G150葡聚糖凝膠層析柱洗脫曲線Fig.2 Elution curve of Sephadex-G200 and Sephadex-G150 column chromatography

CMP4經(jīng)Sephadex-G200和Sephadex-G150葡聚糖凝膠層析柱純化，以苯酚-硫酸法檢測(cè)的洗脫曲線如圖2所示。從曲線圖可見(jiàn)，純化得到單一且高而尖的對(duì)稱洗脫峰，收集吸收峰對(duì)應(yīng)主要試管溶液，經(jīng)真空濃縮、透析、冷凍干燥后獲得組分，命名為CMP44。

2.2 CMP44結(jié)構(gòu)鑒定分析

2.2.1 純度及相對(duì)分子質(zhì)量

圖3 CMP44的HPGPC色譜圖Fig.3 Chromatography of CMP44 by HPGPC

CMP44的高效凝膠色譜圖如圖 3所示。從圖可見(jiàn)，峰形為單一對(duì)稱峰，相對(duì)分子質(zhì)量約20.96×104u，洗脫峰處相對(duì)分子質(zhì)量20.32×104u。根據(jù)苯酚-硫酸法測(cè)定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線y=7.4765x-0.0084，R2=0.9996，計(jì)算出CMP44的多糖含量為99%。

2.2.2 紫外光譜分析

CMP44在260 nm與280 nm處的紫外掃描結(jié)果均沒(méi)有響應(yīng)信號(hào)，說(shuō)明純化后的 CMP44不含有蛋白質(zhì)和核酸，純化效果較好。

2.2.3 紅外光譜分析

圖4 CMP44的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrum diagram of the CMP44

CMP44的紅外光譜掃描結(jié)果如圖 4所示。4000～1650 cm-1呈現(xiàn)出典型的多糖特征吸收峰。其中，3600～3200 cm-1峰形相對(duì)較寬的吸收峰是糖鏈非游離O-H鍵伸縮振動(dòng)產(chǎn)生。

3000～2800 cm-1吸收峰是糖類(lèi)甲基、亞甲基C-H鍵伸縮振動(dòng)產(chǎn)生。1630 cm-1與1420 cm-1附近處的吸收峰為羧甲基特征吸收峰，分別由C=O的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)和次甲基伸縮振動(dòng)產(chǎn)生。890 cm-1附近處為β-吡喃糖特征吸收峰。

2.2.4 單糖組成分析

CMP44經(jīng)水解、乙?；幚砗蟮臍庀嗌V結(jié)果表明，該多糖均一多糖，僅由D-葡萄糖一種單糖組成。

2.2.5 高碘酸氧化和Smith降解分析

根據(jù)已建立的高碘酸氧化反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=9.8983x+0.0017，R2=0.9997，計(jì)算得出 CMP44糖鏈中8.13%為（1→6）連接，79.71%為（1→3）連接，12.16%為（1→4）和（1→2）連接。Smith降解后經(jīng)氣相色譜結(jié)果表明，終產(chǎn)物中含有丙三醇和相應(yīng)單糖葡萄糖，赤蘚醇未檢出。根據(jù)Smith降解反應(yīng)原理，并結(jié)合高碘酸氧化分析結(jié)果推斷出CMP44以（1→3）糖苷鍵為主鏈，含有（1→6）糖苷鍵支鏈，可能含有（1→2）糖苷鍵。

2.2.6 核磁共振波譜分析

圖5 CMP44的1H(a)和13C(b)NMR圖Fig.5 The 1H (a) and 13C (b) NMR spectrum of CMP44

CMP44的1H-NMR、13C-NMR譜如圖5所示。從譜圖分析可知，CMP44含有羧甲基，是以 β-(1,3)糖苷鍵為主鏈的D-葡聚糖結(jié)構(gòu)。

2.2.7 三螺旋結(jié)構(gòu)分析

圖6 不同堿濃度下CMP44與剛果紅混合液的最大吸收波長(zhǎng)變化Fig.6 The maximum absorption wavelength of CMP44-Congo red mixture at different concentrations of NaOH solution

CMP44與剛果紅混合溶液在0～0.5 mol/L NaOH溶液濃度范圍內(nèi)最大吸收波長(zhǎng)的變化情況如圖 6所示。從圖可見(jiàn)，CMP44與剛果紅混合液最大吸收波長(zhǎng)顯著高于不含多糖的剛果紅溶液，說(shuō)明該多糖能和剛果紅形成絡(luò)合物并發(fā)生紅移，這種多糖與剛果紅混合溶液在不同濃度堿溶液中表現(xiàn)出的特殊變化趨勢(shì)，可以證明CMP44具有三螺旋結(jié)構(gòu)。

2.3 CMP44體外抗腫瘤作用分析

MTT法測(cè)定的 CMP44對(duì)腫瘤細(xì)胞 HT-29、HepG-2、SGC-7901、MCF-7以及A549增殖的抑制率結(jié)果如表1所示。

從表1看出，在31.25～1000 μg/mL濃度范圍內(nèi)CMP44樣品對(duì)五種腫瘤細(xì)胞均顯示出不同程度的細(xì)胞增殖抑制活性，并且抑制作用呈劑量依賴性增強(qiáng)。CMP44對(duì)五種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效果不及陽(yáng)性藥5-Fu。CMP44對(duì)SGC-7901抑制效果最好，HT-29細(xì)胞次之，A549細(xì)胞最差，IC50值分別為102.6 μg/mL、140.5 μg/mL、313.2 μg/mL。

表1 CMP44對(duì)五種癌細(xì)胞的抑制效果Table 1 Anti-proliferative effects of CMP44 on five cancer cells(ˉx±s, n=5)(%)

2.4 CMP44體外抗炎作用分析

2.4.1 CMP44干預(yù)對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖影響

分別將不同濃度的CMP44溶液、CMP44溶液和LPS溶液與RAW264.7細(xì)胞共同孵育24 h，MTT法檢測(cè)分析CMP44干預(yù)后細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，如圖7所示。

圖7 CMP44對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響Fig.7 Effects of CMP44 on proliferation of RAW264.7 cells

從圖 7（a）可見(jiàn)，LPS誘導(dǎo)能夠顯著激活RAW264.7細(xì)胞的活性（##p＜0.01）。無(wú)LPS誘導(dǎo)時(shí)，CMP44濃度≤500 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率≥100%，無(wú)細(xì)胞毒性，在濃度為 1000 μg/mL時(shí)，CMP44對(duì)RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率僅為 5.28%，細(xì)胞存活率＞90%。從圖7（b）可見(jiàn)，LPS誘導(dǎo)時(shí)，與LPS組相比，CMP44在低濃度范圍時(shí)對(duì) LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞增殖體現(xiàn)出抑制作用，但顯著不差異（p＞0.05）；濃度≥250 μg/mL 時(shí)，開(kāi)始表現(xiàn)出顯著的抑制作用（p＜0.01），并呈現(xiàn)濃度依賴性關(guān)系。結(jié)果說(shuō)明，CMP44在31.25～1000 μg/mL 濃度內(nèi)對(duì)RAW264.7細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性，且對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用，因此可選擇此濃度梯度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.4.2 CMP44干預(yù)對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響

LPS誘導(dǎo)活化巨噬細(xì)胞釋放的NO可直接或間接的介導(dǎo)免疫反應(yīng)與炎癥反應(yīng)。NO極其不穩(wěn)定，細(xì)胞培養(yǎng)液中能夠快速代謝成為NO2-，因此可采用Griess試劑法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)合已建立的 NO2-標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.00465x+0.02714，R2=0.9992，計(jì)算出 CMP44干預(yù)后RAW264.7細(xì)胞釋放NO含量如圖8所示。

圖8 CMP44對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響Fig.8 Effects of CMP44 on NO of RAW264.7 cells

從圖 8（a）可見(jiàn)，1 μg/mL濃度的 LPS刺激RAW264.7細(xì)胞后，LPS組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量水平顯著高于無(wú)LPS刺激Control組（##p＜0.01），因此說(shuō)明LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)模型成功。與LPS組相比較，CMP44在31.25 μg/mL時(shí)即對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO釋放量顯著降低（**p＜0.01），具有劑量依賴性，劑量為 1000 μg/mL時(shí)NO釋放抑制率達(dá)到46.87%。

結(jié)果表明，CMP44干預(yù)處理對(duì) LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型有抑制作用，能夠顯著抑制由LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞大量釋放NO而發(fā)揮保護(hù)作用。由圖 8（b）可見(jiàn)，CMP44干預(yù)也可誘導(dǎo)無(wú)LPS刺激的 RAW264.7細(xì)胞 NO產(chǎn)生，并且隨著CMP44劑量的增加，生成量逐漸升高，與Control組相比較，CMP44從62.5 μg/mL劑量時(shí)開(kāi)始對(duì)NO的生成出現(xiàn)顯著性差異（##p＜0.01）。經(jīng)CMP44處理后，NO生成量最大值是Control組的3.17倍。

2.4.3 CMP44干預(yù)對(duì) RAW264.7細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α 及 IL-1β 的影響

細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中起著重要的作用[10]。采用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子的IL-6、TNF-α與IL-1β的含量。CMP44干預(yù)對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α及IL-1β的影響如表2所示。

從表2看出，1 μg/mL濃度的LPS誘導(dǎo)RAW264.7后，LPS組細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α及IL-1β含量明顯高于Control組（##p＜0.01）。與LPS組相比較，CMP44干預(yù)從劑量31.25 μg/mL開(kāi)始對(duì)RAW264.7細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放量降低程度表現(xiàn)出顯著性差異（*p＜0.01），抑制作用呈劑量依賴性，劑量為1000 μg/mL時(shí)，對(duì)TNF-α、IL-6和IL-1β的抑制率分別為79.48%、44.33%和34.72%。結(jié)果表明，CMP44處理能夠顯著抑制由LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞大量釋放炎癥因子 TNF-α、IL-6和 IL-1β，具有較強(qiáng)的抗炎活性。

此外，CMP44處理還可誘導(dǎo)無(wú) LPS刺激RAW264.7細(xì)胞的TNF-α、IL-6和IL-1β的產(chǎn)生，具有明顯的劑量關(guān)系。與Control組相比較，CMP44從劑量125 μg/mL開(kāi)始對(duì)TNF-α的表達(dá)出現(xiàn)顯著性差異（##p＜0.01）；劑量62.5 μg/mL 開(kāi)始對(duì)IL-6 的分泌出現(xiàn)顯著性差異（#p＜0.01）；劑量 31.25 μg/mL 開(kāi)始對(duì) IL-1β的分泌出現(xiàn)顯著性差異（#p＜0.05）。1000 μg/mL劑量時(shí)，CMP44對(duì)IL-6的激活最為顯著，IL-6生成量達(dá)到Control組的13.37倍；對(duì)IL-1β的激活作用較強(qiáng)，IL-1β生成量是Control組的8.50倍；對(duì)TNF-α的激活作用較弱，TNF-α生成量?jī)H為Control組的3.17倍。結(jié)果表明，CMP44能夠誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞生成NO、TNF-α、IL-6和IL-1β，呈劑量依賴性，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性。

表2 CMP44對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響Table 2 Effects of CMP44 on cytokine secretion of RAW264.7 cells(ˉx±s, n=5)

3 結(jié)論

3.1 多糖復(fù)雜的結(jié)構(gòu)特征和成分組成決定其具有繁雜多樣的生物學(xué)功能。多糖純度、相對(duì)分子質(zhì)量、糖苷鍵鏈接方式、修飾基團(tuán)取代度大小以及高級(jí)結(jié)構(gòu)等因素都與多糖的性質(zhì)和活性密切相關(guān)[11,12]。分子結(jié)構(gòu)的微小變化和立體結(jié)構(gòu)因素也會(huì)影響多糖活性。此外多糖的純度越高其相應(yīng)的利用價(jià)值就會(huì)越大[13]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)羧甲基化茯苓粗多糖依次經(jīng)0.2 mol/L NaCl溶液洗脫 DEAE-52纖維素、Sephadex-G200和Sephadex-G150層析柱，純化得到純度99%、平均相對(duì)分子質(zhì)量20.96×104u的高純組分CMP44，是單糖組成為D-葡萄糖的均一多糖，主鏈結(jié)構(gòu)為（1→3）-β-D-葡聚糖，含有少量（1→6）-β和（1→2）-β糖苷鍵，并且具有三螺旋結(jié)構(gòu)。大量研究發(fā)現(xiàn)，β構(gòu)型多糖大多具有較強(qiáng)的生物活性，且文獻(xiàn)報(bào)道，含有一定比例（1→6）支鏈的（1→3）-β-D-葡聚糖則顯示出極高的活性[14,15]，因此推測(cè)CMP44可能具有良好生物活性。

3.2 CMP44在31.25～1000 μg/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)五種腫瘤實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的增殖均表現(xiàn)出一定的抑制作用，具有較好的體外抗腫瘤活性，且呈一定的劑量依賴性，抗腫瘤作用大小順序如下所示：SGC-7901＞HT-29＞HepG-2＞MCF-7＞A549。

同時(shí)，CMP44還能夠激活小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞釋放NO、TNF-α、IL-6和IL-1β，具備一定的免疫調(diào)節(jié)作用，且生成量隨著CMP44添加濃度的增加而升高。因此推測(cè)CMP44可能具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力和直接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的雙重抗腫瘤作用。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè) CMP44所具有的（1→3）-β-D-吡喃葡聚糖基本骨架結(jié)構(gòu)為其發(fā)揮抗腫瘤作用的基礎(chǔ)[16]，另外，相對(duì)分子質(zhì)量、分支度等也是影響其抗腫瘤活性的可能因素[17]。

3.3 此外，CMP44在31.25～1000 μg/mL 濃度范圍內(nèi)對(duì)RAW264.7細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性，并且能夠不同程度的抑制由LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的大量釋放從而發(fā)揮抗炎和保護(hù)作用，因此提示 CMP44具有較強(qiáng)的增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗炎活性雙向調(diào)節(jié)作用，其抗炎作用的發(fā)揮推測(cè)是通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞的活性和炎性細(xì)胞因子的合成與分泌，以此阻斷其過(guò)量生成而導(dǎo)致的致炎作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)恢復(fù)平衡；而其細(xì)胞免疫功能的發(fā)揮則可能與其調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子分泌、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力有關(guān)[18]。

3.4 綜上，純化得到的羧甲基茯苓多糖CMP44具有良好的抗腫瘤作用和抗炎作用，同時(shí)還具有一定的調(diào)節(jié)免疫功能，提示其在開(kāi)發(fā)腫瘤治療藥物、急慢性炎癥相關(guān)性疾病的治療藥物以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力保健品等諸多領(lǐng)域都具有較大的潛在應(yīng)用價(jià)值。因此，有待于日后對(duì) CMP44的生物活性開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步驗(yàn)證其活性，并借助蛋白組學(xué)、基因組學(xué)和代謝組學(xué)等多組學(xué)相關(guān)分析技術(shù)在各個(gè)水平上進(jìn)行探討研究其作用機(jī)理，為臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。