甘草酸對酒精性肝損傷大鼠臟器的保護作用：18α-與18β-甘草酸配比的影響

孫曉可，楊颯，霍小位，王士中，孟祥波，趙燕燕

（1.河北大學藥學院，河北省藥物質(zhì)量分析控制重點實驗室，河北 保定 071002）（2.河北祁一堂藥業(yè)有限公司，河北保定 071002）

酒精性肝損傷（Alcoholic Liver Disease，ALD）是由長期過量飲酒造成的一種復雜的代謝性疾病[1]。目前，ALD已經(jīng)成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病病因，嚴重危害著人類的身體健康[2]。酒精的代謝產(chǎn)物如乙醛、乙酸及自由基等對機體的重要組織或器官造成廣泛的氧化損傷，如肝臟、腎臟及脾臟等[2～4]。長期飲酒主要對肝臟造成損傷，病情若不斷發(fā)展則可能導致肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌[5]。飲酒后部分酒精通過腎臟代謝，致使酒精代謝產(chǎn)物積聚在腎臟細胞和腎間質(zhì)內(nèi)，超出其代謝負荷，導致腎臟損傷[6]，包括腎乳頭壞死、感染性血管球性腎炎和急性腎功能衰竭[7～9]。酒精可引起免疫系統(tǒng)失調(diào)，導致脾臟細胞通透性增強，進而使機體免疫功能降低[4,10,11]。過量酒精攝入也能引起腸道通透性增加，損傷腸系膜，進而腸道菌群失調(diào)，內(nèi)毒素進入肝臟，引起肝臟炎癥反應(yīng)[12]。

甘草，氣微，味甜而特異，具有補腎益氣、解毒保肝、潤腸止咳、調(diào)和諸藥、清熱解毒等功效，是一味重要的傳統(tǒng)補益中藥[13]。甘草藥材原植物主要是光果甘草（Glycyrrhiza glabra L），脹果甘草（Glycyrrhiza inflate Batal），甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）三種[14,15]。甘草酸是甘草的主要成分之一，C18位存在差向異構(gòu)體，為 18α-甘草酸（18α-glycyrrhizic acid，18α-Gly）和 18β-甘草酸（18β-glycyrrhizic acid，18β-Gly）。甘草酸對酒精性肝損傷的保護機制和療效已經(jīng)被廣泛報道[16,17]。然而，不同配比的18α-Gly與18β-Gly差向異構(gòu)體對酒精性肝臟、腎臟和脾臟損傷的保護作用的研究尚未見報道。

本研究旨在通過觀察不同配比 18α-Gly與18β-Gly對酒精性肝損傷大鼠重要臟器指數(shù)的影響，分析肝臟、脾臟和腎臟的形態(tài)學變化以進一步篩選出18α-Gly與18β-Gly的最佳配比，為臨床用藥提供實驗數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性大鼠（Sprague-Dawley，8周齡），SPF級，100只，購于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0002。

1.2 主要儀器

萬分之一天平，德國賽多利斯；MICROM HM 325手動輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機，賽默飛世爾科技公司；Leica CM1860冰凍切片機，德國萊卡；ZEISS Primo Start顯微鏡，德國蔡司公司；超低溫冰箱，北京天寒超低溫設(shè)備科技有限公司。

1.3 藥品和試劑

異甘草酸鎂注射液（18α∶18β=500∶1[18]，批號160125104，規(guī)格 50 mg/支）正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司；注射用復方甘草酸單銨 S（18α∶18β=1∶109[18]，批號 20151201，規(guī)格 40 mg/支），山西普德藥業(yè)股份有限公司；水飛薊賓膠囊（純度＞99%，批號650701013，規(guī)格35 mg/粒），天津天士力圣特制藥有限公司；無水乙醇（批號20160301），天津市風船化學試劑有限公司；生理鹽水（批號1604060503），石家莊四藥有限公司；40%甲醛飽和水溶液（批號20160210），天津市華東試劑廠；蘇木精、油紅O，北京索萊寶科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 模型制備與動物分組

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周之后，隨機分為 10組（n=10），即正常對照組（Normal）、模型對照組（Model）、水飛薊賓陽性藥物對照組（Silymarin）、7個18α-Gly與18β-Gly不同配比藥物組（濃度為10.83 mg/kg；配比為 10∶0，8∶2，6∶4，5∶5，4∶6，2∶8，0∶10）。水飛薊賓溶液、18α-Gly與18β-Gly不同配比溶液均用0.9%氯化鈉注射液配制。除正常對照組（0.9%氯化鈉注射液，10 mL/kg）外，各組灌胃（ig）給予40%乙醇，10 mL/kg，制備大鼠酒精性肝損傷模型。藥物組分別灌胃 18α-Gly和 18β-Gly不同配比溶液（10.83 mg/kg），陽性藥物對照組給予水飛薊賓溶液（22.75 mg/kg），正常對照組和模型對照組每100 g給予0.9%氯化鈉注射液0.3 mL，連續(xù)灌胃4周。末次給藥后禁食不禁水14 h，稱重，10%水合氯醛3 mL/kg麻醉，腹主動脈取血，迅速解剖摘取肝臟、腎臟和脾臟等臟器，使用萬分之一天平稱重，置于10%甲醛固定，部分肝臟置于-80 ℃超低溫冰箱凍存。

1.4.2 臟器指數(shù)計算方法

臟器指數(shù)(%)=臟器重量(g)/大鼠體重(g)*100%

1.4.3 肝臟油紅O染色

取-80 ℃的肝臟組織，OTC包埋，組織橫切片（10 μm）及油紅O（Oil Red O）染色，使用蔡司顯微鏡在10倍鏡下連續(xù)觀察整個組織切片病變情況拍照保存。

1.4.4 腎臟和脾臟蘇木精-伊紅染色

取固定在10%甲醛中的腎臟和脾臟組織，石蠟包埋，組織橫切片（4 μm）及蘇木精-伊紅（hematoxylineosin staining，HE）染色，中性樹脂封片，使用蔡司顯微鏡下分別在10倍和40倍鏡下連續(xù)觀察整個組織切片病變情況并拍照保存。

1.4.5 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用 SPSS（19.0版）統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，并進行單因素方差分析（one-way ANOVA）。實驗數(shù)據(jù)以(ˉx±s)表示，p＜0.05 具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同配比18α-Gly與18β-Gly對大鼠酒精性肝損傷各大系統(tǒng)中重要臟器指數(shù)的影響型組相比，#p＜0.05，##p＜0.01，下同。

圖1 不同配比18α-Gly與18β-Gly對酒精性肝損傷大鼠呼吸消化系統(tǒng)臟器指數(shù)的影響Fig.1 Effect of different ratios of 18 α-and 18β-Gly on respiratory and digestive system organs index in ALD rats

圖2 不同配比18α-Gly與18β-Gly對酒精性肝損傷大鼠泌尿生殖系統(tǒng)和運動系統(tǒng)臟器指數(shù)的影響Fig.2 Effect of different ratios of 18 α-and 18β-Gly on urinary,reproductive and sports system organs index in ALD rats

實驗考察不同配比18α-Gly與18β-Gly對酒精性肝損傷大鼠重要臟器指數(shù)的影響（見圖1～3）。酒精導致大鼠重要臟器的損傷，引起大鼠生理功能的變化，如呼吸消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、運動系統(tǒng)和神經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)。酒精對呼吸消化系統(tǒng)臟器造成損傷，肝臟、胰腺、腸系膜和肺指數(shù)受到影響。與正常對照組比較，酒精模型組的肝臟指數(shù)顯著升高，腸系膜和肺指數(shù)明顯降低，胰腺指數(shù)沒有顯著性變化。與酒精模型組比較，18α-Gly 與 18β-Gly 配比為 10∶0、8∶2、4∶6 和 2∶8時肝指數(shù)明顯降低；配比為2∶8和0∶10時可以顯著升高腸系膜指數(shù)；配比為 10∶0、8∶2、6∶4、5∶5 和 2∶8 時肺指數(shù)顯著升高，見圖1a～d。酒精引起泌尿生殖系統(tǒng)和運動系統(tǒng)的損傷。與正常對照組比較，酒精模型組明顯降低骨骼肌指數(shù)，腎臟指數(shù)、睪丸指數(shù)和股骨指數(shù)無顯著性差異。與酒精的模型組相比較，18α-Gly與18β-Gly的配比為2∶8和0∶10時顯著地增加骨骼肌的指數(shù)，具體結(jié)果如圖2a～d所示。酒精對神經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)臟器指數(shù)產(chǎn)生影響。與正常對照組比較，酒精模型組的腦指數(shù)顯著降低，心臟指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著升高。與酒精模型組比較，18α-Gly與18β-Gly配比為2∶8時顯著升高腦指數(shù)；配比為 8∶2、6∶4、4∶6 和 2∶8 時心臟指數(shù)明顯降低；配比為 8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8 和 0∶10時明顯降低脾臟指數(shù)，見圖3a～c。

上述結(jié)果表明，不同配比的 18α-Gly與 18β-Gly對重要臟器指數(shù)的影響不同。18α-Gly與18β-Gly配比為4∶6和2∶8時能顯著降低呼吸消化系統(tǒng)中的臟器肝臟指數(shù)，改善呼吸消化功能；配比為2∶8和0∶10時極顯著降低運動系統(tǒng)中骨骼肌指數(shù)，改善運動功能；配比為2∶8時明顯升高腦指數(shù)，改善神經(jīng)功能；配比為4∶6和2∶8時明顯降低心臟指數(shù)和脾臟指數(shù)。

圖3 不同配比18α-Gly與18β-Gly對酒精性肝損傷大鼠神經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)臟器指數(shù)的影響Fig.3 Effect of different ratios of 18 α-and 18β-Gly on nervous and circulatory organs index in ALD rats

2.2 不同配比18α-Gly與18β-Gly對酒精性肝損傷大鼠肝臟的形態(tài)學分析

圖4 不同配比18α-Gly與18β-Gly對酒精性肝損傷大鼠肝臟形態(tài)學的影響Fig.4 Effect of different ratios of 18α-and 18β-Gly on livermorphology in ALD rats

實驗考察不同配比18α-Gly與18β-Gly對肝臟組織的病理的分析，長期灌胃酒精后對大鼠肝臟造成不同程度損傷，包括肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌。

肉眼觀察（圖4）：與正常對照組比較，酒精模型組的肝體積增大，表面粗糙，油膩，質(zhì)地軟；與酒精模型組比較，18α-Gly 與18β-Gly 配比為4∶6 和2∶8 的肝臟體積恢復，表面油膩感降低。

肝臟油紅O染色結(jié)果顯示（圖4）：與正常對照組比較，酒精模型組肝細胞內(nèi)可見大量紅色脂滴，表明肝細胞內(nèi)出現(xiàn)脂質(zhì)沉積，造成肝臟損傷。與酒精模型組比較，不同配比的18α-Gly與18β-Gly對肝細胞內(nèi)的脂質(zhì)堆積影響不同，配比為4∶6和2∶8時，鏡下可見肝細胞內(nèi)紅色脂滴減少，脂肪變性減輕。

2.3 不同配比18α-Gly與18β-Gly對酒精性肝損傷大鼠腎臟病理的影響

實驗考察不同配比18α-Gly與18β-Gly對腎臟組織病理的影響。酒精約90%在肝臟代謝，部分通過腎臟代謝，引起腎功能下降，腎臟的損傷。

圖5 不同配比18α-與18β-甘草酸對酒精性肝損傷大鼠腎臟病理的影響Fig.5 Effect of different ratios of 18 α-and 18β-Gly on kidney histology in ALD rats

腎臟HE染色結(jié)果顯示（圖5）：正常對照組中腎小球血管袢薄且清晰，細胞正常。與正常對照組比較，酒精模型組腎小球血管袢模糊，玻璃樣變，系膜細胞受損，毛細血管袢分辨不清，炎癥細胞浸潤。給予藥物后，結(jié)果顯示，18α-Gly和18β-Gly的配比為4∶6，2∶8和0∶10，腎小球炎癥細胞減少，毛細血管袢清晰，輕度玻璃樣變。

2.4 不同配比18α-Gly與18β-Gly對酒精性肝損傷大鼠脾臟病理的影響

實驗考察不同配比18α-Gly與18β-Gly對脾臟組織的病理的分析。長期灌胃酒精后造成大鼠肝臟損傷，同時引起脾腫大，引起脾臟損傷。脾臟HE染色結(jié)果顯示（圖6）：正常對照組脾臟紅髓白髓分界清晰，細胞正常。與正常對照組比較，酒精模型組脾臟白髓內(nèi)炎癥細胞浸潤，紅髓內(nèi)紅細胞增多，紅白髓分界模糊。給予藥物后，18α-Gly和18β-Gly的配比為4∶6時脾臟紅白髓分界清，白髓區(qū)明顯擴大。

圖6 不同配比18α-與18β-甘草酸對酒精性肝損傷脾臟病理的影響(H&E染色×10)Fig.6 Effect of different ratios of 18α-and 18β-Gly on spleen histology in ALD rats (H&E staining×10)

3 結(jié)論

3.1 長期過量飲酒，能夠引起代謝異常，酒精代謝物（乙醛、自由基等）抑制臟器的生長發(fā)育，損傷組織[11]。動物的臟器指數(shù)是重要的生物學指標之一，且較為敏感，在一定程度上反應(yīng)器官的功能強弱[19]。本試驗中，采用酒精灌胃復制大鼠 ALD模型，研究酒精對肝臟和脾臟等臟器指數(shù)造成影響。結(jié)果表明，與正常對照組比較，酒精模型組呼吸消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、運動系統(tǒng)和神經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)中的臟器受到損傷，與文獻研究一致[5～11]；不同配比的 18α-Gly 與 18β-Gly對臟器指數(shù)的影響不同，18α-Gly與 18β-Gly配比為2∶8時能顯著降低呼吸消化系統(tǒng)中的臟器指數(shù)，配比為2∶8和0∶10時極顯著降低骨骼肌指數(shù)，配比為2∶8時明顯升高腦指數(shù)，配比為4∶6和2∶8時明顯降低心臟指數(shù)和脾臟指數(shù)。因此，18α-Gly與18β-Gly配比為2∶8和4∶6時明顯改善體內(nèi)各大系統(tǒng)的器官和組織的功能。

3.2 病理檢測能夠真實可靠的顯示出組織的病理狀態(tài)，在本研究中結(jié)合基礎(chǔ)的H&E染色與油紅O染色共同分析組織的病理學變化。Louvet A和Schaeffner E指出酒精對肝臟[1]和腎臟[3]有毒害作用。Pavón FJ等[4]研究間歇飲酒對青少年脾臟組織病理學的影響，發(fā)現(xiàn)酒精使脾臟內(nèi)炎癥細胞浸潤，對脾臟造成損傷。本實驗研究表明，酒精對肝臟、腎臟和脾臟造成損傷，且不同配比的18α-Gly與18β-Gly對組織的形態(tài)學改善作用不同，配比為4∶6和2∶8時肝細胞紅色脂滴減少，脂肪堆積減少；配比小于或等于4∶6時腎小球炎癥減輕，毛細血管袢清晰，玻璃樣變減少；配比為4∶6時脾臟內(nèi)界面紅白髓分界清楚。因此，18α-Gly與18β-Gly配比為4∶6和2∶8時明顯改善肝臟、腎臟、脾臟的組織結(jié)構(gòu)。

3.3 本實驗首次以臟器指數(shù)和病理學為切入點，研究不同配比18α-Gly與18β-Gly對酒精性肝損傷大鼠肝臟、腎臟、脾臟等臟器的影響。研究結(jié)果表明18α-Gly與18β-Gly的配比為4∶6和2∶8時，對ALD大鼠臟器有更好的保護作用。本研究將為甘草酸差向異構(gòu)體的臨床應(yīng)用提供實驗數(shù)據(jù)支持，但其深層機制仍有待于深入研究。