水楊酸和霜霉病誘導(dǎo)黃瓜PCD過程中線粒體相關(guān)基因的表達(dá)分析

王丹丹 遲春寧 白晶 陳沖 池春玉，2 丁國華，2

（1. 哈爾濱師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150025；2. 植物生物學(xué)黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150025；3. 哈爾濱市第六中學(xué)，哈爾濱 150036）

水楊酸（SA）是植物產(chǎn)生過敏反應(yīng)（Hypersensitive Reaction，HR）和系統(tǒng)獲得抗性（Systemic Acquired Resistance，SAR）的內(nèi)源信號(hào)分子，可以誘導(dǎo)抗病基因表達(dá)，在植物的SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用［1］。有很多研究證實(shí)SA介導(dǎo)的HR是一個(gè)程序性細(xì)胞死亡（Programmed cell death，PCD）過程［2-3］。植物發(fā)生HR時(shí)，常伴隨著特異性信號(hào)分子ROS和SA的積累以及染病相關(guān)基因（PR）的表達(dá)，激發(fā)鄰近組織的特異性防御反應(yīng)和植株的SAR［4］。線粒體在 PCD 中扮演重要角色［5］。線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔（Mitochondria permeability transition pore，MPTP）的開放是PCD中發(fā)生的最早事件［6］。MPTP的開放引起線粒體膜電位下降，進(jìn)一步導(dǎo)致氧化磷酸化作用的解偶聯(lián)，膜內(nèi)外離子濃度趨于平衡，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體外膜被破壞和細(xì)胞色素C（Cytochrome C，Cyt C）的釋放，釋放到胞質(zhì)內(nèi)的Cyt C可以激活Caspase等下游關(guān)鍵酶類，使信號(hào)級(jí)聯(lián)放大而觸發(fā) PCD［7-8］。Efthimios［9］研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫處理煙草植株，短時(shí)間鹽脅迫出現(xiàn)線粒體膜去極化、Cyt C釋放和Caspase蛋白含量變化。Janneke［10］研究發(fā)現(xiàn)黃瓜子葉在55℃高溫處理，出現(xiàn)DNA梯狀條帶現(xiàn)象，且通過Western blot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)Cyt C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中［8］。線粒體中新發(fā)現(xiàn)的PCD組分揭示了線粒體在植物中觸發(fā)和執(zhí)行PCD的功能。李家洋研究組通過對(duì)mod1抑制基因的研究發(fā)現(xiàn)，植物的程序性細(xì)胞死亡途徑中存在葉綠體到線粒體的信息交流，蘋果酸-草酰乙酸穿梭途徑在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ROS可以作為誘導(dǎo)線粒體膜透化或線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）形成的誘導(dǎo)PCD的信號(hào)分子，通過Cyt C的釋放和線粒體電子傳遞鏈（mETC）執(zhí)行PCD［11］。

目前在水稻、玉米、擬南芥等植物中分離出一些與PCD相關(guān)的基因，如與玉米性器官原基退化有關(guān)的Ts2基因，大麥中的抗白粉病Mlo基因，擬南芥調(diào)控PCD的LSD1基因和與HR反應(yīng)有關(guān)的3個(gè)基因AP22A，AP33A和AP43A［12-13］。但植物PCD的研究開展較晚，PCD相關(guān)基因的研究遠(yuǎn)沒有動(dòng)物深入，需要分離更多的基因來揭示植物PCD的機(jī)制。RNA-seq測序技術(shù)是一種轉(zhuǎn)錄組測序手段，在已完成基因組測序的物種中，通過將RNA-seq結(jié)果與基因組DNA序列數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，從而得到差異表達(dá)基因、新基因等［14］。

利用10 mmol/L SA誘導(dǎo)處理黃瓜葉片，檢測到黃瓜發(fā)生了PCD，并伴隨著ROS的積累和H2O2產(chǎn)生。獲取黃瓜受SA誘導(dǎo)的PCD相關(guān)基因，研究受SA誘導(dǎo)的PCD相關(guān)基因與黃瓜抗病的相關(guān)性，從中獲取黃瓜抗病相關(guān)線粒體基因，為揭示SA誘導(dǎo)黃瓜PCD和提高黃瓜抗病性的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)。本文根據(jù)對(duì)RNA-seq測序得到1759個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs）結(jié)果進(jìn)行篩選［15-16］，得到16個(gè)與線粒體相關(guān)的DEGs。通過qRT-PCR技術(shù)分析該16個(gè)基因在SA和霜霉病處理下的表達(dá)特征，為獲取介導(dǎo)PCD的關(guān)鍵基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)于2016年5月哈爾濱師范大學(xué)植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試黃瓜自交系9930由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所黃三文教授實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。幼苗在光照培養(yǎng)箱內(nèi)用Hoagland營養(yǎng)液蛭石培養(yǎng)，光照28℃/14 h，黑暗24℃/10 h。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 第4片真葉長出時(shí)選長勢良好的黃瓜幼苗在第3片真葉的葉脈間滴加10 mmol/L的SA（每葉4滴，每滴50 μL），并于滴加前（0 h）和滴加后3 h、12 h、24 h取材4次，每次隨機(jī)選取3株植株，摘取滴加SA的第3片真葉無菌水洗凈揩干，剪取滴加SA部位混合均勻，提取RNA。

選取霜霉病發(fā)病的新鮮葉片，用蒸餾水清洗干凈，放入密封袋，20℃下放置24 h，用毛筆刷取葉片上新長出的孢子囊于無菌水中，制成霜霉菌菌液，濃度為5×105-10×105個(gè)孢子囊/mL。采用滴加法接種病菌，選取長勢良好的四葉期黃瓜植株，在第3片真葉的葉脈間滴加菌液，每葉9滴，每滴50 μL，保濕24 h。于滴加前（0 h）和滴加后36 h、72 h和96 h取材4次，每次隨機(jī)選取3株植株摘取滴加菌液的第3片真葉無菌水洗凈揩干，剪取接菌部位混合均勻，提取RNA。

1.2.2 qRT-PCR測定 上述保存材料的總RNA提取采用天根生化科技有限公司的RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒（離心柱型），詳細(xì)方法見試劑盒說明書。cDNA合成采用寶生物公司的PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒。

根據(jù)基因注釋中是否含有mitochondrial，從1759個(gè) DEGs中［12］篩選出 16個(gè)基因（表 1）。根據(jù)公布的黃瓜基因組基因系列設(shè)計(jì)出qRT-PCR引物如表1，以18S為內(nèi)參基因（引物為ATGATAACTCGACGGATCGC和CTTGGATGTGGTAGCCGT），進(jìn)行qRT-PCR測定。qRT-PCR采用大連寶生物SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒，采用 2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)，確定基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 被篩選的16個(gè)相關(guān)基因及其PCR表達(dá)分析引物

2 結(jié)果

16個(gè)被分析基因的qRT-PCR表達(dá)如表2描述，按照基因響應(yīng)SA和霜霉菌的一致性，可以將這些基因劃分為3類。

第一類基因的表達(dá)量在響應(yīng)SA和霜霉菌上基本一致，都是隨處理時(shí)間延長，表達(dá)量持續(xù)上調(diào)，或上調(diào)至一定程度后下調(diào)，個(gè)別下調(diào)至處理前水平，且上調(diào)幅度都比較大（500%以上）。屬于這類的基因有A、B、F、H、J、L（圖1）。在表達(dá)時(shí)間段上，H上調(diào)響應(yīng)SA和霜霉菌集中在早期，特別是響應(yīng)霜霉菌。J上調(diào)響應(yīng)SA在12 h達(dá)到最高，響應(yīng)霜霉菌在36 h最高。L是逐步上調(diào)響應(yīng)SA和霜霉菌，響應(yīng)SA是12 h達(dá)到最大，響應(yīng)霜霉菌是96 h達(dá)到最大。

第二類基因的表達(dá)量在響應(yīng)SA和霜霉菌時(shí)雖然一致，但表達(dá)量差別很大（圖2）。G和P基因都是上調(diào)，但上調(diào)幅度都很小，最大為處理前的3倍。I基因顯著響應(yīng)SA，但上調(diào)響應(yīng)霜霉菌較微弱，而K基因正好相反，上調(diào)響應(yīng)SA很微弱，但響應(yīng)霜霉菌很強(qiáng)烈，上調(diào)幅度最大達(dá)到17倍。M基因與K基因相似。

第三類基因在響應(yīng)SA和霜霉菌上不一致，基本是上調(diào)響應(yīng)SA，下調(diào)響應(yīng)霜霉菌，屬于這類是基因是C、D、E、N和O（圖3）。其中只有N和O基因響應(yīng)SA的上調(diào)表達(dá)量較高，最大表達(dá)量高于處理前10倍，N響應(yīng)霜霉菌顯著下調(diào)約5倍，而O基本不響應(yīng)霜霉菌。C、D、E雖然都上調(diào)響應(yīng)SA或下調(diào)響應(yīng)霜霉菌，但響應(yīng)幅度都不大，約2-3倍。

表2 被篩選的16個(gè)相關(guān)基因的qRT-PCR表達(dá)分析

圖1 qRT-PCR檢測A、B、F、H、J和L基因在滴加SA（（A）和接種霜霉菌（B）的葉片中的表達(dá)分析

圖2 qRT-PCR檢測G、I、K、M和P基因在滴加SA（A）和接種霜霉菌（B）的葉片中的表達(dá)分析

圖3 qRT-PCR檢測C、D、E、N和O基因在滴加SA（A）和接種霜霉菌（B）的葉片中的表達(dá)分析

3 討論

3.1 SA和霜霉病處理黃瓜葉片實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)差異分析

通過實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)分析SA處理和霜霉病處理下，黃瓜葉片的16個(gè)線粒體相關(guān)基因呈現(xiàn)相似或相悖的表達(dá)趨勢，說明SA誘導(dǎo)的PCD相關(guān)基因在霜霉病誘導(dǎo)的PCD信號(hào)通路中也行使功能。SA與霜霉病對(duì)基因表達(dá)量的影響具有一定的相似性。其中線粒體丙酮酸載體2（A）、抑制素3（B）、雙磷脂酰甘油脫酰酶（F）、解耦聯(lián)蛋白5（G）、線粒體肉堿/?；鈮A載體（H）、甲酸脫氫酶1（I）、氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶1（J）線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)移酶亞家族（K）、脯氨酸脫氫酶2（L）、丙酮酸脫氫酶E1α（M）和乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（P）11個(gè)基因在霜霉病處理中結(jié)果與SA處理相似皆為上調(diào)。SA與霜霉病對(duì)基因表達(dá)量的影響也具有一定的差異性，其中3-羥基異丁酰CoA水解酶（C）、分子伴侶60N-2（D）、甘氨酸脫羧酶（E）、延伸因子Tu（O）和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域跨膜蛋白1（N）5個(gè)基因在SA處理中為上調(diào)表達(dá)，在霜霉病處理過程中也為下調(diào)表達(dá)。按照基因響應(yīng)SA和霜霉菌的一致性，又可以將這些基因劃分為3類。第一類基因的表達(dá)量在響應(yīng)SA和霜霉菌上基本一致，屬于這類的基因有A、B、F、H、J、L。第二類基因的表達(dá)量在響應(yīng)SA和霜霉菌時(shí)雖然一致，但表達(dá)量差別很大，屬于這類的基因有G、I、M、K、P。第三類基因在響應(yīng)SA和霜霉菌上不一致，基本是上調(diào)響應(yīng)SA，下調(diào)響應(yīng)霜霉菌，屬于這類是基因是C、D、E、N和O。說明SA處理下和霜霉病處理下基因的表達(dá)存在差異，可能由于SA和霜霉病引發(fā)的黃瓜葉片PCD發(fā)生方式不同有關(guān)。植物類病變（Lesion mimic，LM）又稱類病斑，指在正常生長條件下，即無明顯機(jī)械損傷、逆境和外界病原菌侵染，植物的局部或整株上自發(fā)產(chǎn)生壞死斑點(diǎn)。這種現(xiàn)象最早在玉米中被發(fā)現(xiàn)，隨后大麥、擬南芥、水稻等植物中也相繼報(bào)道了該表型的突變體。近年來，隨著多個(gè)水稻類病變突變體的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，水稻類病變基因的定位、克隆及作用機(jī)理等方面的研究取得了較大進(jìn)展。SA參與類病斑的產(chǎn)生，SA誘導(dǎo)的PCD就是一種類病斑，因此研究黃瓜的類病斑或者SA誘導(dǎo)的類病斑，分離和鑒定相關(guān)基因，對(duì)揭示黃瓜的抗病機(jī)制和遺傳育種都有積極意義［17-18］。病原體侵害引發(fā)抗病信號(hào)途徑有很多種也存在差異，SA處理黃瓜葉片，被侵染部位發(fā)生局部壞死（即Hypersensitive response，HR），細(xì)胞內(nèi)ROS的爆發(fā)引起PCD的發(fā)生，以抵抗病原菌的的進(jìn)一步擴(kuò)散；非染病部位則長期保持一種抵抗這種病原和其他病原的抗性即系統(tǒng)獲得抗性［19］。HR和SAR相互作用發(fā)生的病原相關(guān)蛋白（Patho-genesis related proteins，PRs）基因的表達(dá)中增強(qiáng)，引發(fā)植物的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。霜霉病是一種病原體的侵害，可以引發(fā)植物一系列的防御機(jī)制，可以識(shí)別損傷細(xì)胞的信號(hào)分子，引發(fā)植物多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終激活抗脅迫基因的表達(dá)［20］。

3.216個(gè)線粒體相關(guān)基因功能分析

根據(jù)基因在SA誘導(dǎo)的黃瓜PCD中的不同表達(dá)情況，推測各基因編碼蛋白的功能分為以下5類：參與線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（甲酸脫氫酶、氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶、抑制素、脯氨酸脫氫酶和丙酮酸脫氫酶）；參與蛋白質(zhì)合成、折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)（延伸因子Tu和分子伴侶）；參與線粒體跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)（線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體、解耦聯(lián)蛋白、線粒體肉堿/?；鈮A載體和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域跨膜蛋白1）；參與線粒體呼吸作用的基因（3-羥基異丁酰CoA水解酶和甘氨酸脫羧酶、雙磷脂酰甘油）；乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶目前未發(fā)現(xiàn)關(guān)于在植物線粒體中的研究報(bào)道。

脯氨酸脫氫酶ProDH基因在SA和霜霉病處理下均為上調(diào)表達(dá)，且是隨處理時(shí)間延長逐步上調(diào)響應(yīng)，該基因在依賴SA的HR反應(yīng)，立枯絲核菌侵染綠豆時(shí)，脯氨酸積累［21］。研究發(fā)現(xiàn)其與SA誘導(dǎo)有關(guān)，通過降低ROS含量和增加對(duì)病原體的敏感性從而降低擬南芥的細(xì)胞死亡率［22］。這證實(shí)該基因參與SA和霜霉病誘導(dǎo)的信號(hào)途徑，對(duì)植物的抗病性起重要作用，可能為誘導(dǎo)植物PCD發(fā)生的關(guān)鍵基因。

延伸因子Tu和分子伴侶在SA和霜霉病的處理下呈相反的趨勢，說明在植物PCD的過程中，參與蛋白質(zhì)合成折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)的基因表達(dá)呈復(fù)雜變化趨勢，可能抑制或促進(jìn)。延伸因子Tu（EF-Tu）存在于及植物的線粒體細(xì)胞內(nèi)，是在mRNA翻譯時(shí)促進(jìn)多肽鏈延伸的蛋白質(zhì)因子。高溫、干旱、低溫以及病原菌侵入等因素可以誘導(dǎo)EF-Tu基因的表達(dá)，提高植物的耐熱、耐旱及抗病性。研究發(fā)現(xiàn)在非生物脅迫下，植物體中EF-Tu的表達(dá)上調(diào)，表明在脅迫過程中EF-Tu基因有重要作用［23］。在高溫和干旱脅迫下，玉米的EF-Tu合成和積累增加。

線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)移酶基因在SA中呈上調(diào)趨勢，而在霜霉病處理下呈下降趨勢。該基因在脅迫處理下可以通過基因的調(diào)控減小植物在脅迫下的損傷，說明研究在植物PCD過程中線粒體跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的基因作用有重要意義。線粒體丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（MPC）存在于線粒體內(nèi)膜，可以介導(dǎo)丙酮酸由細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)入線粒體，是其進(jìn)行三羧酸循環(huán)的重要一步；為脂肪酸、酮類和膽固醇的合成提供醋酸鹽［24］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下煙草MPC基因通過調(diào)節(jié)ABA的釋放，影響保衛(wèi)細(xì)胞跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)及氣孔運(yùn)動(dòng)，提高煙草的抗旱性［25］。

3-羥基異丁酰CoA水解酶（HIBCH）和甘氨酸脫羧酶（GLDC），在SA和霜霉病處理下呈相反的趨勢，而雙磷脂酰甘油（CL）基因呈相似的上調(diào)表達(dá)趨勢。雙磷脂酰甘油（CL）是一種二聚的磷脂，可以參與線粒體呼吸作用和電子傳遞鏈，與線粒體的功能和結(jié)構(gòu)有關(guān)［26］。研究發(fā)現(xiàn)線粒體中的CL基因可以參與細(xì)胞氧化磷酸化和細(xì)胞凋亡過程［27］。

綜上，被研究的16個(gè)基因中線粒體丙酮酸載體2（A）、抑制素3（B）、雙磷脂酰甘油脫酰酶（F）、線粒體肉堿/?；鈮A載體（H）、氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶1（J）、脯氨酸脫氫酶2（L）等6個(gè)基因在響應(yīng)SA和霜霉病處理時(shí)都是上調(diào)表達(dá)，顯示這些基因在SA誘導(dǎo)的PCD過程中承擔(dān)一定的功能；而3-羥基異丁酰CoA水解酶（C）、分子伴侶60N-2（D）、甘氨酸脫羧酶（E）、延伸因子Tu（O）和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域跨膜蛋白1（N）等5個(gè)基因在SA處理中為上調(diào)表達(dá)，在霜霉病處理中卻是下調(diào)表達(dá)，可以推斷這些基因在響應(yīng)SA時(shí)所起的作用與霜霉菌引起的病變關(guān)系不密切；另外5個(gè)基因解耦聯(lián)蛋白5（G）、甲酸脫氫酶1（I）、線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)移酶亞家族（K）、丙酮酸脫氫酶E1α（M）、和乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶（P）等雖然響應(yīng)SA和霜霉菌比較一致，但表達(dá)量的上調(diào)幅度很小，難以說明在黃瓜SA誘導(dǎo)的PCD過程中與霜霉菌引起的HR反應(yīng)中起相似的作用。

4 結(jié)論

本文通過qRT-PCR技術(shù)分析16個(gè)線粒體相關(guān)基因的表達(dá)動(dòng)態(tài)，在SA和霜霉病處理均表達(dá)，其中11個(gè)基因在響應(yīng)SA和霜霉菌上一致，5個(gè)基因不一致。說明SA和霜霉病誘導(dǎo)PCD具有相似性和差異性。16個(gè)基因參與線粒體膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞呼吸作用、蛋白質(zhì)合成、折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)、線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。證實(shí)了在線粒體發(fā)生PCD過程中與這16個(gè)基因有密切關(guān)系。