擬南芥熱形態(tài)建成中PIF4下游基因研究

汪碩 丁嵐 劉建祥，2 韓佳嘉，2

（1. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433；2. 浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310027）

隨著溫室效應(yīng)的加劇，近些年全球氣候逐漸變暖，20世紀(jì)全球平均氣溫約提高0.6℃［1］，經(jīng)預(yù)測(cè)，到2050年平均溫度將可能提高2-5℃［2］。高溫會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生直接影響，在較高環(huán)境溫度下植物會(huì)出現(xiàn)葉片偏下、開(kāi)花提前及下胚軸伸長(zhǎng)等表型，與光形態(tài)建成對(duì)應(yīng)，植物在環(huán)境溫度升高條件下的一些形態(tài)上的改變被稱為熱形態(tài)建成（thermomorphogenesis）?，F(xiàn)有研究表明，調(diào)控這些表型的信號(hào)途徑與植物遮蔭下的分子信號(hào)途徑多有重疊，表型也十分類似［3］。

光和環(huán)境溫度作為最重要的環(huán)境信號(hào)，極大地影響了植物的生長(zhǎng)發(fā)育。光敏色素互作因子（Phytochrome interacting factors，PIFs），是一類可以與光受體光敏色素蛋白相互作用的bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子。PIFs在光調(diào)控的植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中十分重要，能夠影響植物的下胚軸伸長(zhǎng)、幼苗的暗形態(tài)建成、促進(jìn)避蔭反應(yīng)等［4］。29℃的溫和高溫（mild high temperature）能誘導(dǎo)擬南芥野生型幼苗下胚軸伸長(zhǎng)，而PIF4缺失突變體pif4對(duì)溫和高溫不敏感，下胚軸幾乎不伸長(zhǎng)［4］。隱花素（cryptochrome，CRY）是光裂解酶類似的藍(lán)光受體，在擬南芥苗期主要調(diào)控其下胚軸伸長(zhǎng)。CRY1對(duì)溫度響應(yīng)十分重要，而溫和高溫下CRY1通過(guò)與PIF4以藍(lán)光依賴的形式相結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控PIF4在溫和高溫下的轉(zhuǎn)錄活性［5］。最近，有報(bào)道指出光敏色素B（phyB）不僅可作為光的受體，同時(shí)能感應(yīng)環(huán)境溫度的變化［6］，但溫和高溫下phyB到PIF4的信號(hào)傳遞目前不是很清楚。

另外一條獨(dú)立于PIF4的調(diào)控植物響應(yīng)光和溫度信號(hào)，控制下胚軸伸長(zhǎng)的信號(hào)通路包含COP1（CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1）和HY5（ELONGATED HYPOCOTYL 5）。HY5是 bZIP家 族轉(zhuǎn)錄因子，不但在白光下抑制擬南芥下胚軸伸長(zhǎng)，同時(shí)在常溫下也能通過(guò)與PIF4競(jìng)爭(zhēng)下游靶標(biāo)基因啟動(dòng)子來(lái)抑制下胚軸伸長(zhǎng)［7］。在黑暗條件下或環(huán)境溫度升高后，HY5被泛素連接酶COP1降解，從而解除了HY5 對(duì)下胚軸伸長(zhǎng)的抑制效果［7-10］。COP1在細(xì)胞核中發(fā)揮作用，但溫和高溫下COP1如何進(jìn)核的分子機(jī)理目前不清楚。

溫度的升高會(huì)使生長(zhǎng)素表達(dá)水平上升，進(jìn)而調(diào)節(jié)下胚軸伸長(zhǎng)等植物生長(zhǎng)活動(dòng)［11］。有研究表明當(dāng)溫度升高時(shí)，擬南芥中生長(zhǎng)素響應(yīng)基因表達(dá)水平也有所變化［12］。擬南芥在響應(yīng)溫和高溫時(shí)，PIF4能夠直接結(jié)合生長(zhǎng)素合成基因，如YUC8，TAA1，CYP79B2等基因的啟動(dòng)子。PIF4通過(guò)激活TAA1和CYP79B2基因的表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)吲哚乙酸（IAA）的合成［13］。而IAA的積累能夠促進(jìn)AUX/IAA蛋白的降解，進(jìn)而消除對(duì)ARF蛋白的抑制作用。最后ARF通過(guò)激活SAUR19等基因的表達(dá)促進(jìn)胚軸伸長(zhǎng)［14］。其它植物激素，例如，油菜素內(nèi)脂BR和赤霉素GA在植物熱形態(tài)建成中也發(fā)揮著重要的作用［12，15-17］。

本實(shí)驗(yàn)利用擬南芥PIF4缺失突變體和PIF4過(guò)表達(dá)等材料開(kāi)展研究。遺傳分析表明，PIF4、PIF5和PIF7中，PIF4在熱形態(tài)建成中的作用最重要。通過(guò)對(duì)RNA-Seq結(jié)果和結(jié)合CHIP-Seq分析找到了擬南芥熱形態(tài)建成中PIF4調(diào)控的下游基因以及結(jié)合靶標(biāo)基因。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所使用的植物材料有擬南芥（Arabidopsis thaliana）Columbia生 態(tài) 型（Col-0）， 擬 南 芥Columbia背景突變體pif4-101，擬南芥野生型背景下PIF4∶PIF4-myc轉(zhuǎn)基因植株，擬南芥pif4-101背景下PIF4∶PIF4，PIF4∶PIF5，PIF4∶PIF7轉(zhuǎn)基因植株。所使用的菌株有大腸桿菌（Escherichia coli）TOP10， 農(nóng) 桿 菌 菌 株（Agrobacterium tumefaciens）GV3101。這些材料均為本實(shí)驗(yàn)室獲得和保存。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥的平皿培養(yǎng) 將同批收獲的種子放于1.5 mL離心管中，用1 mL 體積比為50%的酒精迅速清洗1次，用體積比0.3%的NaClO消毒15 min后，于超凈臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌水清洗3次，播種在含質(zhì)量濃度1.2%蔗糖的1/2MS固體培養(yǎng)基上。4℃春化2-3 d后置于22℃光照培養(yǎng)箱，光16 h/暗8 h。

1.2.2 下胚軸長(zhǎng)度測(cè)量和分析 將相應(yīng)材料于22℃培養(yǎng)4 d后，在第5天光照開(kāi)始時(shí)移至29℃培養(yǎng)4 d，以22℃培養(yǎng)的植物作為對(duì)照。用相機(jī)分別拍下對(duì)應(yīng)天數(shù)的不同材料的擬南芥幼苗生長(zhǎng)照片，利用ImageJ軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)測(cè)量分析。

1.2.3 RNA-Seq 擬南芥Columbia野生型（wild-type，WT）和pif4-101突變體4℃春化2 d后于22℃培養(yǎng)7 d。在光照開(kāi)始時(shí)將幼苗移至29℃處理1 d，以22℃培養(yǎng)的植物作為對(duì)照。于黑暗周期結(jié)束后收集擬南芥幼苗用于RNA-Seq。根據(jù)Illumina標(biāo)準(zhǔn)步驟構(gòu)建cDNA文庫(kù)，Illumian Hiseq3000測(cè)序（晶能公司）。GO 分析采用 AgriGO（v2.0）進(jìn)行分析［18］。

1.2.4 染色質(zhì)免疫共沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）分別將擬南芥Columbia野生型及PIF4∶PIF4-myc轉(zhuǎn)基因植株于22℃培養(yǎng)，第12天29℃處理24 h，以22℃培養(yǎng)的植物作為對(duì)照。用甲醛固定液固定，后用2.5 mol/L甘氨酸解交聯(lián)，MilliQ水清洗材料3次。去除水分，凍于-80℃保存。將材料用液氮研磨成粉末，加入30 mL EB1，用2層Miracloth過(guò)濾。離心后用1 mL EB2重懸，離心并用300 μL EB3重懸沉淀，并覆蓋于600 μL EB3上。離心并用300 μL NLB重懸沉淀，使用biorupt進(jìn)行超聲，超30 s停30 s。離心取部分上清做Input。其余每個(gè)重復(fù)加入50 μL protein A beads去除與beads的非特異性結(jié)合。取上清加入2 μg myc抗體，于4℃旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。次日加protein A beads 110 μL，4℃ 2 h 后低速離心留 beads。分別用低鹽、高鹽和LiCl和TE緩沖液清洗beads。分兩次加入300 μL 洗脫緩沖液65℃煮15 min，合并。用洗脫緩沖液將Input補(bǔ)齊到500 μL，與免疫沉淀后的DNA-蛋白復(fù)合物一起于65℃解交聯(lián)約6 h。用蛋白酶K去除蛋白，RnaseI去除RNA。沉淀DNA，并用無(wú)水乙醇及70%乙醇清洗沉淀，晾干后用無(wú)菌水溶解。

以MYC抗體沉淀的DNA為模板，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，以actin啟動(dòng)子序列作為陰性對(duì)照。qPCR實(shí)驗(yàn) 使 用 SYBR Premix Ex TaqTMII（TaKaRa） 試 劑，在Bio-Rad CFX96TM儀器上完成。反應(yīng)體系按照TaKaRa及Bio-Rad CFX96TM儀器配制。得到數(shù)據(jù)后分析處理并作圖。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)（qRT-PCR） RNA提取使用植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN），總RNA保存于-80℃。cDNA使用 M-MLV（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄得到，保存在-20℃。

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)使用SYBR Premix Ex TaqTMII（TaKaRa）試劑，在Bio-Rad CFX96TM儀器上完成。反應(yīng)體系按照TaKaRa及Bio-Rad CFX96TM儀器配制。得到數(shù)據(jù)后分析處理并作圖。

2 結(jié)果

2.1 PIF4在擬南芥熱形態(tài)建成中的主要生物學(xué)功能

本實(shí)驗(yàn)在擬南芥PIF4突變體pif4-101背景下采用PIF4自身啟動(dòng)子分別回補(bǔ)PIF4、PIF5和PIF7，利用這3種互補(bǔ)遺傳材料來(lái)研究PIF4及同源蛋白在擬南芥熱形態(tài)建成中的生物學(xué)功能的區(qū)別。野生型擬南芥和pif4-101、PIF4∶PIF5、PIF4∶PIF7在22℃生長(zhǎng)8 d后，4種材料的幼苗下胚軸長(zhǎng)度基本一致（圖1-A），而PIF4∶PIF4的下胚軸則明顯長(zhǎng)于其他材料。而在22℃生長(zhǎng)4 d、29℃生長(zhǎng)4 d的條件下，PIF4∶PIF4的下胚軸伸長(zhǎng)更長(zhǎng)，野生型和PIF4∶PIF5的下胚軸比22℃時(shí)伸長(zhǎng)的幅度接近，而pif4-101、PIF4∶PIF7則幾乎不伸長(zhǎng)（圖1-B）。

基因表表達(dá)分析（圖1-C）表明，PIF4∶PIF4植物中正常條件下PIF4表達(dá)量比野生型中高，可能是PIF4∶PIF4植物正常溫度條件下下胚軸比較長(zhǎng)的原因。這些結(jié)果表明，擬南芥熱形態(tài)建成中PIF7的功能較小，PIF5也具有PIF4類似的功能，但PIF4的功能明顯比PIF5的功能強(qiáng)。因此，PIF4在擬南芥熱形態(tài)建成中具有重要的功能。

圖1 PIF4突變體的表型遺傳互補(bǔ)分析

2.2 熱形態(tài)建成中PIF4調(diào)控的下游基因

為了在全基因組水平上理解熱形態(tài)建成過(guò)程中PIF4調(diào)控的下游基因表達(dá)，將擬南芥野生型和突變體pif4-101在22℃ 培養(yǎng)7 d后，于光周期中白光開(kāi)始時(shí)用29℃處理24 h，在黑暗結(jié)束后取樣，以不處理的植物作對(duì)照，收集幼苗全苗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）。對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后顯示，在擬南芥野生型與pif4-101中分別有602個(gè)基因和512個(gè)基因受溫和高溫處理上調(diào)，并有529個(gè)基因和484個(gè)基因受溫和高溫處理下調(diào)。其中有248個(gè)基因只在野生型中特異上調(diào)，198個(gè)基因只在野生型中特異下調(diào)（圖2，附表）。

圖2 PIF4突變體與野生型熱處理的RNA-SEQ分析

對(duì)于這些只在野生型中上調(diào)的248基因，我們認(rèn)為它們是PIF4依賴的熱響應(yīng)基因。GO分析（圖3）顯示，PIF4依賴的熱響應(yīng)基因中主要參與脫落酸響應(yīng)、生長(zhǎng)素響應(yīng)、幾丁質(zhì)響應(yīng)、脫水響應(yīng)、鹽脅迫、冷馴化等過(guò)程。綜上所述，這些結(jié)果表明，PIF4依賴的熱響應(yīng)基因主要參與植物激素信號(hào)通路和逆境應(yīng)答。

對(duì)于354個(gè)在野生型和突變體pif4-101中上調(diào)的下游基因，對(duì)其上調(diào)幅度也進(jìn)行了比較。結(jié)果（表1）顯示，有21個(gè)基因在pif4-101突變體中的上調(diào)倍數(shù)是野生型（WT）中上調(diào)倍數(shù)的1/2及以下，我們把這些基因視作是部分依賴PIF4調(diào)控的熱形態(tài)建成基因。

2.3 熱形態(tài)建成中PIF4調(diào)控的結(jié)合靶標(biāo)基因

圖3 PIF4依賴的熱響應(yīng)基因GO分析

表1部分依賴PIF4調(diào)控的熱形態(tài)建成基因

為了檢測(cè)上述PIF4依賴和部分依賴的基因是否是PIF4的直接靶標(biāo)基因，我們?cè)跀M南芥野生型背景下過(guò)表達(dá)myc標(biāo)簽融合的PIF4-myc材料（PIFox）。野生型WT和PIF4ox-5、PIF4ox-8轉(zhuǎn)基因材料在22℃正常生長(zhǎng)8 d后，PIF4過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因材料表現(xiàn)出下胚軸變長(zhǎng)的表型。在22℃生長(zhǎng)4 d后移入29℃培養(yǎng)4 d，野生型的下胚軸出現(xiàn)一定程度的伸長(zhǎng)，PIF4過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因材料下胚軸伸長(zhǎng)現(xiàn)象更加明顯（圖4）。這表明PIF4過(guò)表達(dá)材料正常溫度下可能已經(jīng)激活部分下游基因，并且能響應(yīng)環(huán)境溫度升高的變化，這些材料可以用于后續(xù)結(jié)合靶標(biāo)基因的實(shí)驗(yàn)。

圖4 PIF4過(guò)表達(dá)的表型分析

在研究植物激素BR調(diào)控下胚軸伸長(zhǎng)過(guò)程時(shí)，王志勇課題組采用pifq四突變體背景下自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的PIF4-myc過(guò)表達(dá)材料，正常生長(zhǎng)條件下進(jìn)行染色質(zhì)共免疫沉淀深度測(cè)序（ChIP-Seq）分析，得到4583個(gè)候選的PIF4結(jié)合靶標(biāo)基因［15-16］。

為了研究熱形態(tài)建成中PIF4的結(jié)合靶標(biāo)基因，我們比較了上述248個(gè)PIF4依賴的基因以及PIF4候選的結(jié)合靶標(biāo)基因，得到70個(gè)熱形態(tài)建成過(guò)程中被PIF4結(jié)合的候選靶標(biāo)基因。

我們隨機(jī)選擇了7個(gè)靶標(biāo)基因，包括AT1G29395（COR413IM1）、AT1G73120（F-box 蛋白 ）、AT2G47780（LDAP2）、AT3G28857（PRE5）、AT4G14130（XTR7）、AT5G07010（ATST2A）、AT5G18050（SAUR22），利用PIF4-myc過(guò)表達(dá)材料（PIFox-5）進(jìn)行ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果（圖5）表明，AT1G29395、AT3G28857、AT5G18050這 3個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域在正常溫度下就可以被PIF4-myc富集（≥1.5倍，P ＜ 0.05），在環(huán)境溫度升高后7個(gè)候選靶標(biāo)基因中，6個(gè)基因（AT1G29395、AT1G73120、AT2G47780、AT3G28857、AT5G07010、AT5G18050）的啟動(dòng)子區(qū)域被PIF4-myc富集（≥1.5倍，P ＜ 0.05），說(shuō)明通過(guò)生物信息分析得到的70個(gè)PIF4結(jié)合靶標(biāo)基因中絕大部分為實(shí)際PIF4結(jié)合靶標(biāo)基因（附表）。

圖5 PIF4體內(nèi)結(jié)合下游基因啟動(dòng)子的分析

我們也比較了上述21個(gè)PIF4部分依賴的基因以及PIF4候選的結(jié)合靶標(biāo)基因，得到4個(gè)PIF4熱形態(tài)建成過(guò)程中被PIF4結(jié)合的靶標(biāo)基因（表1）。我們把這74個(gè)PIF4結(jié)合靶標(biāo)基因視作熱形態(tài)建成中PIF4結(jié)合的靶標(biāo)基因，這些靶標(biāo)基因是否被PIF4直接結(jié)合可以采用凝膠遷移EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證明。

2.4 PIF4過(guò)表達(dá)對(duì)下游基因的影響

為了研究PIF4過(guò)表達(dá)對(duì)下游基因表達(dá)的影響，將野生型（WT）和PIF4-myc過(guò)表達(dá)材料（PIF4ox-5）進(jìn)行不同溫度處理，檢測(cè)以上提到的7個(gè)基因的表達(dá)情況。結(jié)果（圖6）表明，6個(gè) 基 因（AT1G29395、AT1G73120、AT2G47780、AT3G28857、AT4G14130、AT5G18050）正常溫度下PIF4ox-5中的表達(dá)量高于野生型中的表達(dá)量，只有1個(gè)基因（AT5G07010）在溫和高溫處理后PIF4ox-5中表達(dá)量才高于野生型中的表達(dá)量。

圖6 PIF4過(guò)表達(dá)對(duì)下游基因表達(dá)的影響

3 討論

bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子PIF4與關(guān)敏色素phyB互作，參與植物光形態(tài)建成，后續(xù)更多的研究表明，PIF4是植物熱形態(tài)建成中的重要調(diào)控節(jié)點(diǎn)［19-23］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，在幾個(gè)PIFs中，PIF4在植物熱形態(tài)建成中功能最重要。PIF4基因的表達(dá)受時(shí)鐘的調(diào)控，同時(shí)也受溫和高溫的誘導(dǎo)［20，24］。PIF4蛋白也受到翻譯后修飾調(diào)控。例如，在白光下phyB和BIN2可以磷酸化PIF4，導(dǎo)致PIF4的降解［25-26］。環(huán)境溫度升高后磷酸化的PIF4積累［27］，這主要與DET1穩(wěn)定PIF4有關(guān)［7］。此外，PAR1和CRY1也可以與PIF4互作，溫和高溫下抑制PIF4 的轉(zhuǎn)錄活性［5，28-29］。

PIF4的靶標(biāo)基因中有很多是植物激素合成和響應(yīng)基因［12，15］，因此一般認(rèn)為PIF4在熱形態(tài)建成中主要通過(guò)植物激素，如生長(zhǎng)素途徑發(fā)揮作用［11，23］。事實(shí)上，生長(zhǎng)素合成基因比如YUC8和生長(zhǎng)素響應(yīng)基因比如IAA4 和IAA29，受溫和高溫的誘導(dǎo)上調(diào)并且依賴于PIF4［13，20］。但是，PIF4在全基因組水平的熱形態(tài)建成中的下游基因并未見(jiàn)報(bào)道。我們采用RNA-Seq的方法，得到了溫和高溫處理后受PIF4調(diào)控的269個(gè)下游基因（包括21個(gè)PIF4部分依賴的下游基因）。這些基因中生長(zhǎng)素響應(yīng)途徑的基因（IAA6、IAA19、IAA34、SAUR22、SAUR57、SAUR59）和脫落酸響應(yīng)途徑的基因得到顯著富集。此外，一些細(xì)胞壁伸長(zhǎng)相關(guān)基因和逆境脅迫響應(yīng)基因也得到富集。我們的結(jié)果為理解植物熱形態(tài)建成的基因調(diào)控提供了幫助。

這些PIF4調(diào)控的熱形態(tài)建成下游基因中，據(jù)估算大約有25%為熱形態(tài)建成中PIF4調(diào)控的結(jié)合靶標(biāo)基因，其他為PIF4間接調(diào)控的下游基因。例如，編碼膜蛋白COR413IM1的基因AT1G29395被證明是PIF4的直接調(diào)控基因。溫和高溫處理下的該基因的誘導(dǎo)表達(dá)依賴于PIF4，野生型中組成性表達(dá)PIF4正常溫度下該基因上調(diào)表達(dá)。而編碼細(xì)胞壁成分、改變有關(guān)的木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶XTR7的基因AT4G14130并不被PIF4直接結(jié)合，是PIF4間接調(diào)控的下游基因。溫和高溫處理下該基因的誘導(dǎo)表達(dá)也依賴于PIF4，野生型中組成性表達(dá)PIF4正常溫度下該基因也上調(diào)表達(dá)。

此外，PIF4對(duì)下游靶標(biāo)基因的結(jié)合能力也有差別，當(dāng)PIF4組成性表達(dá)后，有的靶標(biāo)基因在正常溫度下就可以被PIF4結(jié)合，而有些靶標(biāo)基因只有在溫和溫度處理后才被PIF4結(jié)合。例如，編碼磺基轉(zhuǎn)移酶ATST2A的AT5G07010啟動(dòng)子只有在溫和高溫處理下才顯著被PIF4結(jié)合。溫和高溫處理下該基因的誘導(dǎo)表達(dá)依賴于PIF4，野生型中組成性表達(dá)PIF4，正常溫度下該基因沒(méi)有上調(diào)表達(dá)，但溫和高溫處理后該基因明顯誘導(dǎo)表達(dá)。這些結(jié)果暗示其他的溫和高溫處理依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子可能與PIF4一起調(diào)控了該基因的表達(dá)。PIF4過(guò)表達(dá)植物正常條件下下胚軸伸長(zhǎng)，溫和高溫下有進(jìn)一步的伸長(zhǎng)，而在檢測(cè)的7個(gè)基因中，只有1個(gè)基因（ATST2A）的表達(dá)量在PIF4過(guò)表達(dá)植物中溫和高溫下有進(jìn)一步上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明一部分PIF4調(diào)控基因在溫和高溫下對(duì)下胚軸的伸長(zhǎng)非常重要。

4 結(jié)論

獲得擬南芥熱形態(tài)建成中248個(gè)PIF4完全依賴和21個(gè)PIF4部分依賴的下游基因，這些下游基因主要參與植物激素和非生物逆境響應(yīng)。這些PIF4調(diào)控的熱形態(tài)建成下游基因有74個(gè)基因是PIF4結(jié)合靶標(biāo)候選基因。選擇7個(gè)PIF4候選靶標(biāo)基因，有6個(gè)基因被PIF4直接結(jié)合。

注：本論文中附表見(jiàn)電子版（http://biotech.caas.cn）