HPLC法測定螞蟻中膽固醇的含量

馬春娟，單柏宇，路 芳，徐 陽

(1.長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林長春 130031；2.白城市食品藥品監(jiān)督管理所，吉林白城 137000)

螞蟻作為保健品被人類所食用具有悠久的歷史，對治療人類疾病方面具有重要作用。全世界有15000種螞蟻，我國約有2000種，其中具有食用和藥用價值的約有10種，例如擬黑多刺蟻、雙突多刺蟻、黃猄蟻、大黑蟻、巨頭切葉蟻、日本弓背蟻、鋪道蟻等[1-4]。國內(nèi)外文獻(xiàn)資料表明，可食用螞蟻營養(yǎng)價值高，并具有多種保健和治療疾病的功能，堪稱“微型動物營養(yǎng)寶庫”和“天然藥物加工廠”[5-6],例如抗病毒、抗炎、增強(qiáng)免疫、清除乙肝病毒的功能[7]，對腎虛、頭昏耳鳴、失眠多夢、陽痿遺精、風(fēng)濕痹痛、中風(fēng)偏癱、手足麻木、紅斑性狼瘡、硬皮病、皮肌炎、癰腫疔瘡、毒蛇咬傷有一定療效，尤其是在抗疲勞方面尤為突出[8-10]。

膽固醇又稱膽甾醇，是一種環(huán)戊烷多氫菲的衍生物。膽固醇具有重要的藥理作用，對維持人體正常的生理功能具有重要作用[11-13]。膽固醇是激素類物質(zhì)合成的原料，可經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化為類固醇激素，類固醇激素對抗疲勞方面具有重要作用，故膽固醇的含量對螞蟻抗疲勞活性具有重要影響[14]。過高地攝入膽固醇可形成高脂血癥，引起動脈粥樣硬化，進(jìn)而誘發(fā)冠心病、高血壓等一系列心腦血管疾病[15-17]。因此，適度控制外源性膽固醇攝入是預(yù)防動脈粥樣硬化及心腦血管疾病的重要措施，故測定螞蟻中膽固醇的含量可以指導(dǎo)特定人群對螞蟻及其提取物的食用量[18-19]。

目前，國內(nèi)文獻(xiàn)尚沒有關(guān)于HPLC法測定螞蟻中膽固醇含量的相關(guān)報道。因此，建立一種快速、高效的膽固醇含量的測定方法是非常必要的。本文利用HPLC法檢測螞蟻中膽固醇的含量，方法精密度高，快捷、有效，為螞蟻的鑒別、質(zhì)量控制和食用指導(dǎo)奠定研究基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試藥

電子天平(AVW20D型，日本島津制作所)；超聲波清洗器(KQ-400KDE型，昆山市超聲儀器有限公司)；液相色譜儀(Aglient 1260型，美國安捷倫有限公司)。

水為娃哈哈純凈水；膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥98%，批號：111618-200301)；甲醇為色譜純，二氯甲烷為分析級試劑。螞蟻(經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室李波老師鑒定為螞蟻，產(chǎn)地見表1)

1.2 對照品的配制

精密稱取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品約5.0mg，置100mL容量瓶中，加入適量甲醇超聲溶解，甲醇定容至刻度，即濃度為0.05mg/mL膽固醇對照品溶液。

1.3 供試品溶液的配制

取適量螞蟻放置于105℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥約7～8h至恒重，冷卻研磨至粉末。精密稱取螞蟻粉末約10g，加200mL的二氯甲烷超聲提取約15min，同法提取3次，合并濾液，回收溶劑，用適量甲醇溶解，至10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性實驗

色譜柱為Agilent TC-C18(250mm×4.6mm，5μm),流動相為甲醇∶水(V/V,98∶2)，流速為1mL/min，檢測波長為205nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10μL。理論塔板數(shù)按照膽固醇計算均不小于3000，在此條件下，膽固醇與其它物質(zhì)分離度大于1.5，符合藥典要求，色譜圖見圖1、圖2。

2.2 線性關(guān)系考察

精密稱取膽固醇對照品10.51mg，置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得濃度為1.05mg/mL的膽固醇母液。精密吸取膽固醇母液2mL、1mL、0.5mL、0.3mL、0.1mL、0.1mL，置于10mL、10mL、10mL、10mL、10mL、25mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，即濃度為0.2102mg/mL、0.1051mg/mL、0.0525mg/mL、0.0315mg/mL、0.0105mg/mL和0.0042mg/mL溶液。按照2.1中色譜條件分別將溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰面積。以色譜峰面積(Y)對溶液濃度(X)作圖，得到膽固醇的回歸方程為Y=6.3845X-5.3825，r=0.9996(n=6)，表明膽固醇濃度在0.0042～0.2102mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 精密度試驗

分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液(20170301)各10μL，按照2.1中色譜條件重復(fù)注入高效液相色譜儀6次，測得膽固醇色譜峰面積的RSD值分別為1.02%和1.91%，結(jié)果表明此方法精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性考察

將供試品溶液(20170301)，分別在0，2，4，6，8，10，12h時，依次進(jìn)樣，測得膽固醇色譜峰面積的RSD值為1.68%(n=7)，結(jié)果表明供試品溶液中膽固醇在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性實驗

按照1.3中供試品配制方法，分別配制6份螞蟻(20170301)供試品溶液，依法進(jìn)行含量測定，并計算出其含量的RSD值為1.87%，結(jié)果表明此方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率實驗

精密稱取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品5.05mg，定容至10mL，吸取1mL，分別加入6份約5g的螞蟻樣品(20170301)中，按照1.3中供試品配制方法進(jìn)行配制，得6份加樣回收率供試品，進(jìn)入高效液相，測定含量，計算回收率。結(jié)果膽固醇的平均回收率為99.12%，RSD值為1.77%(n=6)，表明此方法回收率良好。

2.7 樣品測定

取品種不同產(chǎn)地的螞蟻樣品，按照制備供試品方法制備，分別精密吸取對照品和供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀中，進(jìn)行含量測定，記錄色譜峰面積，并按照外標(biāo)法計算供試品溶液中膽固醇的含量，結(jié)果見表1。

表1 不同產(chǎn)地螞蟻中膽固醇的含量

3 討論

對比浸漬法、超聲提取法和熱回流提取法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取法和熱回流提取法提取效率較高，但是由于熱回流提取法提取時間較長，且操作復(fù)雜，故最終確定超聲提取法。

對比甲醇-水，乙腈-水，甲醇-磷酸-水，乙腈-磷酸-水的色譜條件，最終確定甲醇-水為最佳的流動相。由于膽固醇的極性較小，水相比例的增大，雖然可以提高膽固醇的分離效果，但對出峰時間影響較大，同時考慮分離效果和測定效率，最終確定甲醇-水(V/V，98∶2)。

對比不同波長對樣品含量測定的影響，發(fā)現(xiàn)膽固醇在較低波長下具有良好的吸收，但由于吸收波長較低，基線的波動較大，且影響膽固醇供試品中膽固醇的分離，故最終選取波長為205nm。

膽固醇具有多方面的藥效作用，是螞蟻中重要的甾體類成分，不僅可以直接影響螞蟻抗疲勞方面的藥效作用，且對于其它甾體類成分的合成具有重要影響，故本文建立一種可以快速和準(zhǔn)確測定螞蟻中膽固醇的方法，為螞蟻的質(zhì)量控制奠定研究基礎(chǔ)。本文對東北地區(qū)擬黑多刺蟻和紅螞蟻中膽固醇的含量進(jìn)行測定，并進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)同品種，不同產(chǎn)地的擬黑多刺蟻和紅螞蟻膽固醇的含量差異很大，紅螞蟻中膽固醇的含量要普遍高于擬黑多刺蟻中的含量。