食管癌組織中VEGF-C表達(dá)量與淋巴管新生及腫瘤組織生長(zhǎng)的相關(guān)性

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院 胸外科，河北 保定 071000)

食管癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，早期診斷率較低且預(yù)后較差、死亡率較高。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是食管癌重要的轉(zhuǎn)移途徑，區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是造成腫瘤復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的主要原因，也是導(dǎo)致預(yù)后不良的重要因素[1-2]。局部組織中新生淋巴管生成是造成癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但關(guān)于食管癌組織中淋巴管新生的調(diào)控機(jī)制尚未闡明。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)是VEGF家族中具有促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)新生淋巴管生成作用的成員，已有研究證實(shí)食管癌組織中VEGF-C的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織及正常組織[3]。但是，關(guān)于VEGF-C與食管癌組織淋巴管新生、病灶生長(zhǎng)的關(guān)系仍未見(jiàn)明確報(bào)道。本研究分析食管癌組織中VEGF-C表達(dá)量與淋巴管新生、腫瘤組織生長(zhǎng)的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

選取2012年4月-2015年10月在河北大學(xué)附屬醫(yī)院接受手術(shù)切除的食管癌組織作為臨床標(biāo)本，共86例。其中，男性47例，女性39例；年齡(62.89±7.93)歲；根治性手術(shù)63例，姑息性手術(shù)23例；中高分化47例，低未分化39例；TNMⅠ、Ⅱ期44例，TNM Ⅲ、Ⅳ期42例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例。所有患者術(shù)前均未接受過(guò)放化療，手術(shù)后經(jīng)病理切片確診為食管癌。術(shù)后將手術(shù)切除的食管癌標(biāo)本分為2份，一份用石蠟包埋、另一份用液氮冷凍。

1.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判讀方法

選擇石蠟包埋的食管癌組織，制作石蠟切片后采用武漢博士德生物有限公司SP法免疫組織化學(xué)染色試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，脫蠟至水后滴加3%過(guò)氧化氫、37℃、5 min，清洗2～3次后將切片浸入枸櫞酸緩沖液并進(jìn)行抗原熱修復(fù)15 min，而后分別加入VEGFC、淋巴管特異性標(biāo)志物D2-40的第一抗體，37℃孵育1 h后清洗，滴加第二抗體后37℃孵育30 min，DAB顯色、蘇木精復(fù)染，最后進(jìn)行脫水以及中性樹(shù)脂封片。

1.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判讀方法

VEGF-C定位于胞漿中、鏡下呈棕黃色判斷為陽(yáng)性，隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占比例，將染色明顯、定位明確且陽(yáng)性細(xì)胞＞20%的組織切片判斷為VEGF-C陽(yáng)性；D2-40定位于毛細(xì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿，在低倍鏡下觀察并選取淋巴管最豐富的區(qū)域，轉(zhuǎn)換為高倍視野并對(duì)D2-40陽(yáng)性染色的淋巴管數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)

選擇液氮冷凍的食管癌組織，采用動(dòng)物組織總RNA抽提試劑盒和cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，抽提食管癌組織中的RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取cDNA樣本，設(shè)計(jì)細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki-67和細(xì)胞周期素B1(Cyclin B1)的特異性引物并進(jìn)行熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)，根據(jù)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)的擴(kuò)增曲線計(jì)算Ki-67和Cyclin B1的mRNA含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床病理特征食管癌組織中的VEGF-C表達(dá)量及淋巴管密度

不同性別、年齡食管癌組織中VEGF-C的陽(yáng)性率及淋巴管密度(lymphatic vessel density,LVD)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；低未分化食管癌組織中VEGF-C的陽(yáng)性率及LVD與中高分化比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，低未分化均高于中高分化；TNMⅢ、Ⅳ期食管癌組織中VEGF-C的陽(yáng)性率及LVD與TNMⅠ、Ⅱ期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，TNM Ⅲ、Ⅳ期均高于TNMⅠ、Ⅱ期；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌組織中VEGF-C的陽(yáng)性率及LVD與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均高于無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移的食管癌組織。見(jiàn)表1。

2.2 不同臨床病理特征食管癌組織中的增殖分子表達(dá)量

不同性別、年齡食管癌組織中Ki-67、Cyclin B1的mRNA含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；低未分化食管癌組織中Ki-67、Cyclin B1的mRNA含量與中高分化比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，低未分化均高于中高分化；TNM Ⅲ、Ⅳ期食管癌組織中Ki-67、Cyclin B1的mRNA含量與TNMⅠ、Ⅱ期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，TNM Ⅲ、Ⅳ期均高于TNMⅠ、Ⅱ期；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌組織中Ki-67、Cyclin B1的mRNA含量與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌組織。見(jiàn)表2。

表1 不同臨床病理特征食管癌組織中的VEGF-C表達(dá)量及LVD

2.3 不同VEGF-C表達(dá)量食管癌組織中的LVD及增殖分子表達(dá)量

VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)的食管癌組織的LVD以及Ki-67、Cyclin B1的mRNA含量與VEGF-C陰性表達(dá)的食管癌組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)均高于VEGF-C陰性表達(dá)。見(jiàn)表3。

表2 不同臨床病理特征食管癌組織中的增殖分子表達(dá)量 (±s)

表2 不同臨床病理特征食管癌組織中的增殖分子表達(dá)量 (±s)

臨床病理特征例數(shù)Ki-67t值P值Cyclin B1t值P值年齡≥60歲381.07±0.14 0.4920.108 1.03±0.12 0.3740.142＜60歲480.97±0.110.96±0.11性別男471.05±0.12 0.2270.227 1.06±0.14 0.3150.193女390.98±130.94±0.10分化程度高中分化470.65±0.080.57±0.07 14.5850.002低未分化391.39±0.231.49±0.18 11.9410.003 TNM分期Ⅰ、Ⅱ440.61±0.070.65±0.08 13.4220.0019.3840.007Ⅲ、Ⅳ421.45±0.261.37±0.16淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)490.57±0.07 18.7690.000 0.46±0.06 22.6270.000有371.60±0.271.79±0.22

表3 不同VEGF-C表達(dá)量食管癌組織中的LVD及增殖分子表達(dá)量 (±s)

表3 不同VEGF-C表達(dá)量食管癌組織中的LVD及增殖分子表達(dá)量 (±s)

VEGF-C表達(dá)LVDKi-67Cyclin B1 VEGF-C陽(yáng)性(n =48)11.96±1.781.66±0.221.57±0.18 VEGF-C陰性(n =38)5.29±0.760.53±0.070.61±0.08 t值12.32819.76915.527 P值0.0030.0010.002

3 討論

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是食管癌最常見(jiàn)和最主要的轉(zhuǎn)移途徑，它直接決定腫瘤的分期，影響患者的預(yù)后。研究淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制和調(diào)控因素對(duì)食管癌的早期診斷和判斷預(yù)后有著重要意義[4-5]。VEGF-C是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的VEGF家族成員之一，不僅能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)新生血管的生成，還能夠作用于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞并促進(jìn)其增殖，進(jìn)而增加局部組織中新生淋巴管的數(shù)目[6-7]。近年來(lái)，VEGF-C促進(jìn)淋巴管新生的作用受到了越來(lái)越多的關(guān)注，已有研究報(bào)道[8-9]食管癌組織中VEGF-C的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織以及正常食管組織且VEGF-C的表達(dá)量與腫瘤的臨床病理分期有關(guān)。本研究中對(duì)不同臨床病理特征食管癌組織中VEGF-C的表達(dá)量進(jìn)行分析，所得結(jié)果與國(guó)內(nèi)學(xué)者毛廣顯[8]以及李幼梅[9]相一致:食管癌的TNM分期越高、分化程度越低，VEGF-C的陽(yáng)性表達(dá)率越高，且發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌組織中VEGF-C的陽(yáng)性表達(dá)率高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌組織。

食管癌組織中新生淋巴管的生成能夠?yàn)榘┘?xì)胞的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供直接通路，淋巴管新生過(guò)程越旺盛、腫瘤的進(jìn)展越迅速。VEGF-C在食管癌中呈高表達(dá)的趨勢(shì)已經(jīng)得到一致認(rèn)可，但VEGF-C是否靶向調(diào)節(jié)食管癌病灶內(nèi)淋巴管的新生卻仍未闡明。為了明確食管癌組織中高表達(dá)的VEGF-C對(duì)淋巴管新生的調(diào)控作用，本研究采用D2-40單克隆抗體對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記并對(duì)腫瘤組織中淋巴管進(jìn)行計(jì)數(shù)，由不同臨床病理特征食管癌組織中LVD的比較可知:食管癌的TNM分期越高、分化程度越低，LVD越高，且發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌組織中LVD高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌組織。這就說(shuō)明腫瘤病灶內(nèi)的淋巴管新生參與腫瘤的進(jìn)展、分化和轉(zhuǎn)移過(guò)程。進(jìn)一步分析不同VEGF-C表達(dá)情況對(duì)LVD的影響可知:VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)能夠增加食管癌組織的LVD。這就說(shuō)明食管癌組織中VEGF-C對(duì)淋巴管新生具有調(diào)控作用，VEGF-C表達(dá)越高、淋巴管數(shù)目越多。

在食管癌病情的進(jìn)展過(guò)程中，局部新生的淋巴管不僅能夠?yàn)榘┘?xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供通路，還能夠?yàn)槟[瘤組織的生長(zhǎng)提供所需的營(yíng)養(yǎng)成分、促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖。Ki-67是細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，是反映細(xì)胞增殖活力的常用指標(biāo)，其表達(dá)量越高、細(xì)胞增殖越旺盛；Cyclin B1是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的重要蛋白質(zhì)，與CDK1結(jié)合后能夠加速細(xì)胞周期的發(fā)展、促進(jìn)細(xì)胞的增殖[10-12]。本研究對(duì)食管癌組織中Ki-67、Cyclin B1表達(dá)量的分析來(lái)反映腫瘤病灶內(nèi)細(xì)胞增殖的狀態(tài)，結(jié)果顯示，食管癌的TNM分期越高、分化程度越低，Ki-67、Cyclin B1的mRNA含量越高，且發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌組織中Ki-67、Cyclin B1的mRNA含量高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌組織。進(jìn)一步分析不同VEGF-C表達(dá)情況對(duì)Ki-67、Cyclin B1表達(dá)的影響可知:VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)能夠增加食管癌組織的Ki-67、Cyclin B1的mRNA含量。這就說(shuō)明食管癌組織中VEGF-C對(duì)細(xì)胞增殖具有調(diào)控作用，VEGF-C表達(dá)越高、Ki-67和Cyclin B1的表達(dá)量越高、細(xì)胞增殖越活躍。

綜上所述，食管癌組織中高表達(dá)的VEGF-C與淋巴管新生以及腫瘤組織生長(zhǎng)密切相關(guān)，VEGF-C能夠促進(jìn)新生淋巴管的形成以及腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞的增殖。