間歇性低壓低氧對(duì)大鼠肺動(dòng)脈高壓的預(yù)防作用及血管保護(hù)機(jī)制

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 心內(nèi)科，河北 石家莊 050031)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary artery hypertension,PAH)是以肺動(dòng)脈壓力升高以及血管痙攣、內(nèi)膜增生和重構(gòu)為主要特征的一種病理狀態(tài)，目前對(duì)PAH的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，但已明確內(nèi)皮功能失調(diào)是PAH發(fā)生及發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ)，因此恢復(fù)受損的血管內(nèi)皮功能是治療PAH的重要策略。間歇性低壓低氧(intermittent hypobaric hypoxia,IHH)是指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物間斷暴露于低壓低氧環(huán)境，而其余時(shí)間處于常壓常氧環(huán)境中。已有研究表明，IHH對(duì)機(jī)體有很多益處，但國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)對(duì)PAH大鼠具有預(yù)防及保護(hù)作用的研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用野百合堿(Monocrotaline,MCT)誘導(dǎo)雄性SD大鼠PAH模型，觀察IHH對(duì)PAH大鼠模型的肺組織及肺血管功能學(xué)、形態(tài)學(xué)的作用，并初步探討其對(duì)肺血管的保護(hù)機(jī)制，為臨床治療PAH提供新的實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)健康雄性SD大鼠40只購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重150～200 g。大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組8只(CON組)、肺動(dòng)脈高壓組12只(PAH組)、間歇性低壓低氧組8只(IHH組)和IHH+MCT組12只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及實(shí)驗(yàn)溶液的配置

1.2.1 實(shí)驗(yàn)藥品 MCT、苯腎上腺素(Phenylephrine,PHE)、乙酰膽堿(Acetylcholine,ACH)、4%水合氯醛溶液。

1.2.2 Krebs-Henseleit(KH)溶液的配制 氯化鈉NaCl 3.45 g，氯化鉀KCl 0.175 g，氯化鈣CaCl20.1 g，磷酸二氫鉀KH2PO40.0815 g，硫酸鎂MgSO40.148 g，碳酸氫鈉NaHCO31.05 g，葡萄糖1.1 g(pH 7.35～7.45)，配置成500 ml溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)

1.3.1 CON組 大鼠飼養(yǎng)28 d后直接用PE-50管檢測(cè)右心室收縮壓(right heart systolic pressure,RVSP)及肺動(dòng)脈平均壓(mean pulmonary artery pressure,mPAP)，計(jì)算右心室肥厚指數(shù)(right ventricular hypertrophy index,RVHI)，并用血管環(huán)灌流實(shí)驗(yàn)觀察血管反應(yīng)性的改變。本組實(shí)驗(yàn)持續(xù)28 d。

1.3.2 PAH組 大鼠先正常飼養(yǎng)14 d，后以60 mg/kg的劑量一次性腹腔注射MCT，以誘導(dǎo)大鼠慢性PAH模型，在注射14 d后測(cè)量PAP，如果＞25 mmHg則入組。本組實(shí)驗(yàn)持續(xù)28 d。

1.3.3 IHH組 大鼠置于模擬5 km海拔高度(氧濃度11.1%，大氣壓400 mmHg)的低壓低氧艙，6 h/d，其余時(shí)間仍處在正常氧氣及氣壓條件下，連續(xù)經(jīng)受28 d的IHH后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本組實(shí)驗(yàn)持續(xù)28 d。

1.3.4 IHH+MCT組 大鼠先接受上述的低壓低氧處理28 d后，用MCT以60 mg/kg劑量一次性腹腔注射，14 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本組實(shí)驗(yàn)持續(xù)42 d。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法和步驟

1.4.1 復(fù)制PAH模型 PAH組實(shí)驗(yàn)大鼠一次性腹腔注射MCT溶液(60 mg/kg)，有研究表明，在注射14 d即可形成理想的大鼠PAH模型[1-3]。該研究在注射MCT后14 d應(yīng)用Powerlab生物信息采集與處理系統(tǒng)中的肺動(dòng)脈壓力測(cè)定模板測(cè)量肺動(dòng)脈壓(PAP)，如果PAP＞25 mmHg時(shí)，則認(rèn)為復(fù)制模型成功。本實(shí)驗(yàn)中大鼠經(jīng)測(cè)量均復(fù)制成功。

1.4.2 血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定 大鼠稱重后用水合氯醛行腹腔注射麻醉。啟動(dòng)Powerlab生物信息采集與處理系統(tǒng)，接通三通管后與換能器和監(jiān)護(hù)儀相連，并將壓力校零備用。將麻醉后的大鼠暴露右側(cè)頸總靜脈后用PE-50管緩緩插入，PE-50管的另一端與壓力換能器相連，緩慢操縱導(dǎo)管，根據(jù)屏上所顯示的壓力值與壓力曲線的變化來(lái)判斷導(dǎo)管的位置，當(dāng)出現(xiàn)典型的右心室壓力波形及肺動(dòng)脈壓力波形后，固定導(dǎo)管位置，記錄Powerlab生物信息采集處理系統(tǒng)中的RVSP及PAP值，通過(guò)數(shù)據(jù)分析得出mPAP壓力值。

1.4.3 RVHI的計(jì)算 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)束后迅速開胸，將心臟取出并用K-H液沖洗干凈。剪下心臟后沿著房室間溝剪去心房及周圍血管組織，之后經(jīng)肺動(dòng)脈出口沿肺動(dòng)脈圓錐、室間隔將右心室游離壁分離，余下的即為左心室及室間隔組織(Left ventricle and septum，LV+S)，用濾紙吸干組織上的水分后秤量RV游離壁以及LV+S的重量，計(jì)算RV/(LV+S)%比值即為RVHI，反映肺動(dòng)脈高壓的程度。

1.4.4 大鼠離體肺動(dòng)脈環(huán)的復(fù)制 將上述開胸后的大鼠剪取左肺葉置于K-H液硅膠培養(yǎng)皿中并固定，在顯微鏡下暴露肺葉內(nèi)的肺動(dòng)脈及其分支，剝離兩側(cè)結(jié)締組織，游離出肺動(dòng)脈，選取直徑介于300～500 μm的肺中動(dòng)脈剪成長(zhǎng)約為2 mm的離體肺動(dòng)脈環(huán)。

1.4.5 肺動(dòng)脈環(huán)體外灌流實(shí)驗(yàn)的操作步驟 打開DMT Myograph Systems，將肺血管環(huán)懸掛于預(yù)置5 ml K-H液的浴槽內(nèi)，并進(jìn)行血管的標(biāo)準(zhǔn)化來(lái)算出血管的初始張力，基線穩(wěn)定后用PHE(10-5mol/L)收縮血管環(huán)達(dá)張力峰值，加入ACH(10-5mol/L)檢驗(yàn)血管內(nèi)皮完整性。反復(fù)沖洗，待血管環(huán)重新穩(wěn)定后，加入累積濃度的PHE(10-8～10-5mol/L)，即加入1個(gè)濃度的PHE，待反應(yīng)穩(wěn)定之后再加入另一濃度，獲取濃度-效應(yīng)曲線反映血管內(nèi)皮依賴性收縮功能；反復(fù)沖洗待血管環(huán)張力重新平衡后，用PHE(10-5mol/L)預(yù)收縮血管環(huán)引起最大收縮反應(yīng)后，逐漸加入系列濃度梯度(10-8～10-5mol/L)的ACH，從而獲得ACH的累積濃度-效應(yīng)曲線反映內(nèi)皮依賴性血管舒張功能。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

肺動(dòng)脈環(huán)體外灌流實(shí)驗(yàn)的每組數(shù)據(jù)先分別計(jì)算不同濃度梯度下藥物對(duì)離體肺動(dòng)脈血管環(huán)的收縮或舒張的張力值，然后用血管環(huán)的收縮或舒張張力值占PHE(10-5mol/L)的最大收縮百分比表示，并繪出累積濃度-效應(yīng)曲線。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為服從正態(tài)分布的計(jì)量資料，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，4組數(shù)據(jù)比較運(yùn)用單因素方差分析，當(dāng)多組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般生長(zhǎng)狀況與死亡情況

PAH組大鼠從腹腔注射MCT后1周開始體重較對(duì)照組減輕，倦臥，喘促，活動(dòng)量、進(jìn)食量減少。處死后開胸，可見(jiàn)肺表面光滑，呈灰白色，彈性差，多處局灶性瘀血，右心室明顯增厚。IHH組大鼠的活動(dòng)度、進(jìn)食狀況及重量均較PAH組有所改善，但較CON組差，處死后見(jiàn)肺表面光滑，呈粉色，但彈性差。CON組大鼠處死后可見(jiàn)肺表面光滑，呈粉紅色，富有彈性。PAH組死亡2只大鼠，其余各組大鼠均全部存活。死亡大鼠行解剖實(shí)驗(yàn)，肉眼可見(jiàn)有胸腹腔積液，摘取心、肺組織后，可見(jiàn)肺組織瘀點(diǎn)、瘀斑，短軸橫切心臟，可看到右室游離壁肥大。

2.2 各組大鼠RVSP和mPAP比較

4組大鼠RVSP和mPAP比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。PAH組的RVSP和mPAP與其他3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，PAH組高于其他3組；IHH+MCT組大鼠的RVSP和mPAP與PAH組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，IHH+MCT組低；IHH+MCT組、IHH組的RVSP和mPAP與CON組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，IHH+MCT組和IHH組偏高。見(jiàn)表1和圖1。

表1 各組大鼠RVSP、mPAP、RV、LV+S及RVHI比較 (±s)

表1 各組大鼠RVSP、mPAP、RV、LV+S及RVHI比較 (±s)

注:1)與CON組比較，P ＜0.05；2)與CON組比較，P ＞0.05；3)與PAH組比較，P ＜0.05

組別RVSP/mmHgmPAP/mmHgRV/mgLV+S/mgRVHI/%CON組(n =8)24.464±1.21416.423±0.4660.103±0.0360.420±0.0280.244±0.038 PAH組(n =10)45.145±0.6231)35.282±0.9461)0.246±0.0631)0.582±0.0321)0.488±0.0281)IHH組(n =8)25.743±1.1632)17.863±0.4282)0.161±0.0272)0.504±0.0322)0.277±0.0422)IHH+MCT組(n =12)27.585±0.9872)3)19.456±1.0352)3)0.125±0.0242)3)0.488±0.0452)3)0.256±0.0412)3)F值11.24710.14319.54825.17924.434 P值0.0000.0000.0000.0000.000

圖1 各組大鼠RVSP、mPAP比較

2.3 各組大鼠RV、LV+S和RVHI比較

4組大鼠RV、LV+S、RVHI比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。PAH組的RV、LV+S、RVHI與其他3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，PAH組高于其他3組，IHH+MCT組的上述指標(biāo)較PAH組顯著降低；IHH+MCT組、IHH組的指標(biāo)與CON組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但I(xiàn)HH+MCT組和IHH組偏高。見(jiàn)表1和圖2。

圖2 各組大鼠RV、LV+S和RVHI比較 (±s)

2.4 各組大鼠離體肺動(dòng)脈的血管功能

在4組中，PHE從10-8mol/L到10-5mol/L均可引起血管內(nèi)皮依賴性收縮反應(yīng)，ACH從10-8mol/L到10-5mol/L都可引起血管的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)，且以上實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)血管的收縮及舒張作用都具有濃度依賴性。

2.4.1 離體肺動(dòng)脈環(huán)對(duì)PHE的血管內(nèi)皮依賴性收縮反應(yīng) 由PHE誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈環(huán)的血管內(nèi)皮依賴性收縮功能PAH組大鼠與CON組大鼠比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，PAH組減弱(見(jiàn)表2)，這種效應(yīng)在PHE的量效關(guān)系曲線上表現(xiàn)為曲線的右移(見(jiàn)圖3)。但是，IHH+MCT組的內(nèi)皮依賴性的收縮功能較PAH組增強(qiáng)，即IHH預(yù)處理28 d可改善PAH組大鼠受損的肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性收縮功能。

2.4.2 離體肺動(dòng)脈環(huán)對(duì)ACH的血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng) ACH誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈環(huán)的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能PAH組大鼠與CON組大鼠比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，PAH組減弱(見(jiàn)表2)，這種效應(yīng)在ACH的量效關(guān)系曲線上表現(xiàn)為曲線的右移(見(jiàn)圖4)。但是，IHH+MCT組的內(nèi)皮依賴性舒張功能較PAH組增強(qiáng)，即IHH預(yù)處理28 d后可改善PAH組大鼠受損的肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能。

圖3 各組由PHE誘導(dǎo)的離體肺動(dòng)脈環(huán)的血管內(nèi)皮依賴性收縮功能比較

表2 各組大鼠累積濃度的收縮及舒張效應(yīng) %

圖4 各組由ACH誘導(dǎo)的離體肺動(dòng)脈環(huán)的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能比較

3 討論

已有研究表明，IHH對(duì)機(jī)體多種組織、器官均有益處[4-6]，例如可保護(hù)神經(jīng)及肝臟等器官組織[7]；可對(duì)抗代謝綜合征大鼠的血壓升高和胰島素抵抗[8]；也有文獻(xiàn)報(bào)道IHH可對(duì)抗缺血/再灌注所致心功能損傷及心律失常[9]，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)缺血、缺氧的耐受性；SANCHIS-GOMAR[10]等的研究證明IHH對(duì)心肌梗死的預(yù)防和恢復(fù)均有保護(hù)作用；FARIAS[11]等的研究也證明IHH對(duì)運(yùn)動(dòng)員在常氧運(yùn)動(dòng)時(shí)紅細(xì)胞的生成、最大攝氧量和能量消耗具有保護(hù)作用。有關(guān)IHH對(duì)機(jī)體的有益作用日益受到關(guān)注，但其對(duì)PAH的預(yù)防作用目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道均少見(jiàn)。

目前關(guān)于PAH的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但已明確內(nèi)皮功能失調(diào)是PAH發(fā)生及發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ)[12]。正常情況下血管內(nèi)皮細(xì)胞可分泌內(nèi)皮依賴性舒張因子(endothelium-derived relaxing factor,EDRF)及內(nèi)皮依賴性收縮因子(endothelium-dependent contraction factor,EDCF)作用于平滑肌細(xì)胞而發(fā)揮血管活性作用。如果發(fā)生內(nèi)皮功能障礙，則NO等EDRF減少或活性降低，而O2等EDCF釋放增加，使肺血管收縮及重構(gòu)，最終導(dǎo)致PAH，因此恢復(fù)受損的血管內(nèi)皮功能是治療PAH的重要策略。

本研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)過(guò)IHH預(yù)處理的實(shí)驗(yàn)組大鼠MCT腹腔注射后2周，其肺動(dòng)脈壓力升高，右心室肥厚，而這種效應(yīng)能夠被IHH預(yù)防治療所消減。因此得出這樣的結(jié)論:IHH干預(yù)后可降低MCT所誘導(dǎo)的升高的大鼠肺動(dòng)脈壓及右心室肥厚。

LIN等[13]的研究表明MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠離體肺動(dòng)脈由ACH介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)減弱，其潛在的機(jī)制可能是血管平滑肌細(xì)胞對(duì)EDCF的敏感性增高以及對(duì)內(nèi)皮源性的NO的反應(yīng)性降低[14]。ELIF等[15]將MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠于21d后處死，游離出肺動(dòng)脈主干做離體肺動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)，并使用去甲腎上腺素預(yù)收縮肺動(dòng)脈干后觀察其由電場(chǎng)刺激介導(dǎo)的舒張反應(yīng)，結(jié)果顯示與正常對(duì)照組相比，PAH組電場(chǎng)刺激介導(dǎo)的舒張功能消失，這表明MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠電場(chǎng)刺激介導(dǎo)的舒張功能減弱是由于內(nèi)皮NO的產(chǎn)生受抑制而引發(fā)。

本研究在血管環(huán)灌流實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在MCT誘導(dǎo)的PAH組中，由ACH誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)較正常對(duì)照組大鼠降低，這與MAM等[16]的研究結(jié)果相同。但是，IHH+MCT組的內(nèi)皮依賴性舒張功能較PAH組增強(qiáng)，即IHH預(yù)處理28 d后可改善PAH組大鼠受損的肺動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能。因此，通過(guò)上述結(jié)果筆者推斷早期運(yùn)用IHH對(duì)MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺動(dòng)脈的舒張功能具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是由于肺血管結(jié)構(gòu)的改變降低了其對(duì)血管收縮物質(zhì)的反應(yīng)性，這與WITTMER等[17]的研究相同。也有學(xué)者研究證實(shí)IHH能夠通過(guò)開放動(dòng)脈血管KATP通道和增加NO濃度減緩MCT誘導(dǎo)的PAH的進(jìn)展，改善內(nèi)皮依賴性的血管舒張功能[18-19]。

本研究應(yīng)用先進(jìn)的DMT Myograph Systems，為臨床治療PAH提供一種預(yù)處理的非藥物性措施及新的思路，同時(shí)也有助于更加深入地理解PAH的病理進(jìn)展。