金絲桃苷抗抑郁作用參與5-HT能系統(tǒng)可能機(jī)制研究

鄭梅竹，范亞軍，潘 炎，時(shí)東方，劉春明

(1.長(zhǎng)春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室,吉林長(zhǎng)春 130032；2.長(zhǎng)春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130032；3.長(zhǎng)春師范大學(xué)高等教育研究所，吉林長(zhǎng)春 130032)

抑郁癥是一種以心情低落、食欲不振嚴(yán)重時(shí)會(huì)產(chǎn)生自殺念頭為顯著特征的神經(jīng)退行性疾病，嚴(yán)重危害現(xiàn)代社會(huì)人類(lèi)的身心健康[1]。目前，對(duì)抑郁癥的相關(guān)研究開(kāi)展較多，但其確切的發(fā)病機(jī)制尚未明確。在已報(bào)道的眾多發(fā)病機(jī)制中，去甲腎上腺素(NE)、5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)單胺神經(jīng)遞質(zhì)與抑郁癥的發(fā)病機(jī)理最為大眾認(rèn)可和接受。而單胺能系統(tǒng)在中樞神經(jīng)中擔(dān)任重要角色。尤其是5-HT能系統(tǒng)在抑郁癥的治療中占據(jù)重要地位。經(jīng)典的抗抑郁藥物鹽酸氟西汀(百解憂(yōu))是基于顯著提高人體內(nèi)5-HT的含量發(fā)揮作用。目前，新的治療抑郁癥藥物不斷涌現(xiàn)，但由于其存在抗抑郁作用比較狹窄、且具有耐藥性、同時(shí)因其毒副作用較大、用藥后不良反應(yīng)極其明顯等缺點(diǎn)嚴(yán)重制約了在臨床上的廣泛使用，因此開(kāi)發(fā)新型具有寬抗抑郁、高效低毒的抗抑郁藥物成為研究的重要熱點(diǎn)。而天然藥物由于其來(lái)自自然且毒副作用小、有廣闊的應(yīng)用前景，越來(lái)越受到醫(yī)務(wù)工作者和科研工作者的推崇[2]。

黃酮類(lèi)化合物廣泛存在于天然藥用植物、水果和蔬菜中，具有利尿、清熱、平肝和安神的功效，有研究表明在抗氧化、抗高血壓和抗腫瘤方面具有明顯的藥理作用[3]，近年來(lái)，陸續(xù)報(bào)道了黃酮類(lèi)化合物的抗抑郁作用[4-5]。而金絲桃苷是從黃酮類(lèi)化合物中分離出來(lái)的單體成分，且含量較高，前期結(jié)果表明金絲桃苷具有明確的抗抑郁活性[6]，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究在采用小鼠強(qiáng)迫游泳、小鼠懸尾和自主實(shí)驗(yàn)對(duì)金絲桃苷的抗抑郁活性進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，選用5-HT相關(guān)受體(5-HT1A、5-HT2、5-HT2A)及其阻斷劑Way100635、賽庚啶、酮舍林，深入研究金絲桃苷參與抗抑郁活性的5-HT能神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

金絲桃苷，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，純度在99.9%以上；生理鹽水，購(gòu)自吉林大藥房，批號(hào)：20150215。鹽酸氟西汀膠囊，上海中西制藥有限公司，批號(hào)：100102。受體阻斷劑Way100635、cyproheptadine、ketanserin均購(gòu)自美國(guó)sigma公司；DMSO，長(zhǎng)春鼎國(guó)生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體重18～22g雄性ICR小鼠,購(gòu)自吉林長(zhǎng)春生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物在正常的12h光照,12h黑暗時(shí)間表下活動(dòng)。環(huán)境溫度和相對(duì)濕度分別保持在22±1℃和55±5%。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

多功能細(xì)胞讀板器(MD,Sunnyvale,CA.USA)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組和給藥方法

五組實(shí)驗(yàn)小鼠，每組10只，設(shè)為對(duì)照組(生理鹽水組)，陽(yáng)性對(duì)照組(鹽酸氟西汀膠囊，5mg/kg)，3個(gè)金絲桃苷給藥處理組(給藥濃度分別為10、20、30mg/kg)，所有藥物通過(guò)灌胃以20mL/kg體重的劑量使用，1次/天，持續(xù)10天。最后一次給藥1h后，開(kāi)始進(jìn)行動(dòng)物行為學(xué)的檢測(cè)。

1.4.2 小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)

小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)根據(jù)Porsolt建立的方法[7]進(jìn)行檢測(cè)。小鼠單獨(dú)在開(kāi)放的圓柱形容器(直徑10cm，高25cm)中強(qiáng)迫游泳，該容器水溫25±1℃，水深19cm，每只動(dòng)物在6分鐘的過(guò)程中保持不動(dòng)的總時(shí)間被記錄為不動(dòng)時(shí)間(以秒為單位)。每只小鼠在停止掙扎時(shí)被判定為不動(dòng)，并且在水中保持懸浮不動(dòng)，只做出必要的動(dòng)作以保持頭部高于水面。不動(dòng)時(shí)間的減少表明具有抗抑郁作用。

1.4.3 小鼠懸尾試驗(yàn)

尾部懸浮試驗(yàn)(TST)根據(jù)Steru等建立的方法[8]進(jìn)行檢測(cè)。使用懸尾夾子，在距離盒子(250mm×250mm×300mm)尾部10mm，頭部距離底部5cm處將小鼠分別懸掛在尾部。在具有最小背景的黑暗房間中測(cè)試噪聲，每只小鼠懸掛6分鐘，在最后4分鐘間隔記錄不動(dòng)時(shí)間。判定標(biāo)準(zhǔn)是小鼠停止掙扎，完全靜止不動(dòng)。

1.4.4 小鼠自主運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)

為了評(píng)估金絲桃苷對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)行為的影響，將小鼠單獨(dú)放置在暗室的矩形容器(40cm×40cm×25cm)中，配備有攝像機(jī)，自動(dòng)記錄小鼠在5min中內(nèi)的自主活動(dòng)情況。每個(gè)腔室的地板表面用70%乙醇徹底清潔。

1.4.5 金絲桃苷對(duì)給予5-HT相關(guān)受體阻斷劑小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)的影響

取健康小鼠40只，隨機(jī)分為4組：生理鹽水對(duì)照組，Way100635 0.1mg/kg組/cyproheptadine 5mg/kg組/ketanserin 3mg/kg組，金絲桃苷20mg/kg給藥組，金絲桃苷20mg/kg+Way100635 0.1mg/kg組/cyproheptadine 5mg/kg組/ketanserin 3mg/kg組。灌胃給藥，每天一次，持續(xù)十天，末次給藥1h后，除生理鹽水對(duì)照組、金絲桃苷20mg/kg給藥組外，其余各組均皮下注射Way100635 0.1mg/kg/cyproheptadine 5mg/kg/ketanserin 3mg/kg，而對(duì)照組經(jīng)皮下注射同等體積10mL/kg的生理鹽水，30min后分別將小鼠尾部2cm處的部分固定于懸尾支架上，使小鼠呈倒掛狀態(tài)，其頭部離臺(tái)面約5cm，每只動(dòng)物兩側(cè)用板隔開(kāi)，遮擋動(dòng)物視線(xiàn)，使之互不干擾。適應(yīng)1min，觀察記錄5min持續(xù)累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)以X±SD表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 金絲桃苷對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳行為的影響

金絲桃苷對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳行為影響實(shí)驗(yàn)表明陽(yáng)性對(duì)照藥鹽酸氟西汀、金絲桃苷10mg/kg、20mg/kg給藥組均能明顯縮短小鼠強(qiáng)迫游泳累積不動(dòng)時(shí)間(P<0.05)(表1)。

表1 金絲桃苷對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳行為的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 金絲桃苷對(duì)小鼠懸尾行為的影響

與對(duì)照組相比金絲桃苷10mg/kg、20mg/kg給藥組能明顯縮短懸尾小鼠的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間(P<0.05)，尤其是20mg/kg給藥組與陽(yáng)性對(duì)照組效果幾乎一致(表2)。

表2 金絲桃苷對(duì)小鼠懸尾行為的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 金絲桃苷對(duì)小鼠自主運(yùn)動(dòng)行為的影響

金絲桃苷各給藥組小鼠的自主運(yùn)動(dòng)情況與陽(yáng)性對(duì)照和空白之間沒(méi)有顯著差異。結(jié)果表明在實(shí)驗(yàn)所使用的金絲桃苷抗抑郁劑量范圍內(nèi)沒(méi)有明顯的中樞興奮或抑制作用(P>0.05)(表3)。

表3 金絲桃苷對(duì)小鼠自主運(yùn)動(dòng)行為的影響

2.4 5-HT1A受體阻斷劑對(duì)金絲桃苷作用的影響

金絲桃苷給藥組能明顯縮短懸尾小鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；但是金絲桃苷與5-HT1A受體阻斷劑Way100635聯(lián)合給藥后對(duì)懸尾小鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間無(wú)明顯的延長(zhǎng)，與Way100635組和金絲桃苷組相比差異均不顯著(P>0.05)(表4)。

表4 金絲桃苷對(duì)給予5-HT1A受體阻斷劑Way100635小鼠懸尾試驗(yàn)的影響

注：與照組比，*P<0.05；與Way100635比，﹟﹟P<0.01。

2.5 5-HT2A受體阻斷劑對(duì)金絲桃苷作用的影響

金絲桃苷給藥組能明顯縮短懸尾小鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間,與對(duì)照差異顯著(P<0.05)；但是金絲桃苷與5-HT2A受體阻斷劑cyproheptadine同時(shí)給藥明顯延長(zhǎng)懸尾小鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間，與cyproheptadine組和金絲桃苷組相比差異顯著(P<0.01)(表5)。

表5 金絲桃苷給予5-HT2A受體阻斷劑Cyproheptadine小鼠懸尾試驗(yàn)的影響

注：與照組比：*P<0.05;與Cyproheptadine，##P<0.01;與金絲桃苷比，△△P<0.01。

2.6 5-HT2受體阻斷劑對(duì)金絲桃苷作用的影響

金絲桃苷給藥組能明顯縮短懸尾小鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間,與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；而金絲桃苷與5-HT2受體阻斷劑ketanserin同時(shí)給藥明顯延長(zhǎng)懸尾小鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間，與ketanserin組和金絲桃苷組相比差異顯著(P<0.01)(表6)。

表6 金絲桃苷對(duì)給予5-HT2受體阻斷劑ketanserin小鼠懸尾試驗(yàn)的影響

注：與照組比,*P<0.05；與ketanserin比,##P<0.01；與金絲桃苷比,△△P<0.01。

3 討論

小鼠強(qiáng)迫游泳和小鼠懸尾是較為常用的、經(jīng)典的抑郁癥動(dòng)物模型。模型所體現(xiàn)出的小鼠絕望、行為扭曲等狀態(tài)是體外模擬抑郁癥的顯著特征，同時(shí)由于其對(duì)抗抑郁藥物比較敏感且便于操作，因此是抗抑郁藥物常用的篩選模型[9]。本研究采用這兩種經(jīng)典的抑郁動(dòng)物模型對(duì)金絲桃苷的抗抑郁活性進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)價(jià)與驗(yàn)證。結(jié)果表明，金絲桃苷能顯著縮短小鼠強(qiáng)迫游泳和小鼠懸尾的累積不動(dòng)時(shí)間，同時(shí)對(duì)小鼠的自主活動(dòng)沒(méi)有明顯的影響，表明金絲桃苷具有明確的抗抑郁作用。

抑郁癥的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，包括受體假說(shuō)、細(xì)胞因子假說(shuō)、單胺假說(shuō)等。其中單胺假說(shuō)認(rèn)為抑郁癥的發(fā)病與神經(jīng)遞質(zhì)水平的下降密切相關(guān)是最為大家廣泛認(rèn)可接受的。而單胺系統(tǒng)中5-羥色胺在突出間隙的缺乏或者水平持續(xù)下降在抑郁癥的發(fā)病進(jìn)程中起著重要作用[6]。5-HT能與其它的神經(jīng)中樞相互傳導(dǎo)，同時(shí)參與中樞神經(jīng)對(duì)外部環(huán)境刺激所引起的適應(yīng)性反應(yīng)。Amat等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生應(yīng)激事件時(shí)大鼠中縫核的5-HT能神經(jīng)元的活性被激活并大幅度的提升。Henn等[11]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于長(zhǎng)期隔離飼養(yǎng)的大鼠，由于環(huán)境隔絕導(dǎo)致情緒低落，發(fā)現(xiàn)其海馬內(nèi)5-羥色胺能的釋放量明顯減少。Ruhé[12]等研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于嚴(yán)重的抑郁癥患者，在長(zhǎng)期服藥偶然停藥后，會(huì)導(dǎo)致情緒低落，這與患者體內(nèi)5-HT的缺失或其水平的急劇降低有密切關(guān)系。本研究結(jié)果證實(shí)金絲桃苷具有明確的抗抑郁活性，其作用機(jī)理與5-羥色胺能系統(tǒng)(5-HT2A、5-HT2受體系統(tǒng))有確切的關(guān)系。金絲桃苷抗抑郁活性作用的發(fā)揮與其它神經(jīng)遞質(zhì)是否存在密切的關(guān)系，需要進(jìn)一步的深入探討。