基于生物信息學(xué)的條斑紫菜microRNAs及其靶標(biāo)預(yù)測

尹旭崗，馮 佳，呂俊平，劉 琪，南芳茹，謝樹蓮，高 帆

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

條斑紫菜 （Porphyra yezoensis） 屬紅藻綱（Florideophyceae）紅毛菜科（Bangiaceae）紫菜屬，富含蛋白質(zhì)、多糖以及維生素，可供食用或藥用，多分布于日本、韓國及中國的北方，是我國重要的經(jīng)濟(jì)海藻之一[1]。隨著環(huán)境條件的日益惡化，作為大型海洋經(jīng)濟(jì)紅藻之一的條斑紫菜，面臨著種質(zhì)退化、品質(zhì)降低和資源減少的危機(jī)。為緩解以上危機(jī)，條斑紫菜新品種的選育日益緊迫，而基因后轉(zhuǎn)錄水平的遺傳改良是實現(xiàn)高效分子育種的必要途徑。作為抑制基因后轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的非編碼RNA，microRNA（miRNA）在植物的生長發(fā)育、新陳代謝及脅迫響應(yīng)等方面起重要的調(diào)控作用。傳統(tǒng)實驗方法鑒定miRNAs較繁瑣，對于非編碼RNA研究較薄弱的條斑紫菜，利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測miRNAs及其靶標(biāo)可極大地提高鑒定效率。

miRNA是一類具有基因后轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼小RNA。LEE等[2]在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中首次發(fā)現(xiàn)了這類特殊的RNA分子。在相關(guān)酶及蛋白因子的作用下，原始miRNA經(jīng)過2次剪切，最終形成長度約21 nt左右的成熟體，并通過切割抑制與翻譯抑制2種方式實現(xiàn)對基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[3]。研究證實，miRNAs在植物生長發(fā)育、新陳代謝、脅迫響應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其他生命活動中均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[4]。自2002年首次在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)miRNA以來，植物miRNA研究已有了快速的發(fā)展[5]。截至2018年1月，研究者們已在34種植物中發(fā)現(xiàn)miRNA成熟體序列約8 500條（miRBase 21.0[6]。作為一種重要的模式經(jīng)濟(jì)海藻，條斑紫菜miRNAs研究起步較晚。2010年，LIANG等[7]利用高通量測序聯(lián)合生物信息的方法鑒定到231條條斑紫菜miRNAs，其中，7條為物種特異miRNAs；2012年，HE等[8]通過對條斑紫菜孢子體和配子體小RNA的高通測序，鑒定到14條新的miRNAs；之后再無該海藻miRNAs的相關(guān)報道。

目前，獲得miRNAs的主要方法有直接克隆[9]、正向遺傳[2]、深度測序[10]和生物信息[11]。與動物相比，植物間的miRNA序列相對保守，在考慮試驗成本及鑒定效率的前提下，利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測植物的miRNAs及其靶標(biāo)基因是可行的[12]。

本研究以條斑紫菜為研究對象，已公布植物miRNAs為探針，以條斑紫菜ESTs為模板，利用生物信息技術(shù)預(yù)測條斑紫菜miRNAs及其前體二級結(jié)構(gòu)，對miRNA靶標(biāo)基因及其功能進(jìn)行預(yù)測，分析了條斑紫菜miRNA序列的保守性與多態(tài)性。研究結(jié)果進(jìn)一步擴(kuò)充了紫菜miRNA及其靶基因信息數(shù)據(jù)，為條斑紫菜功能的開發(fā)與應(yīng)用、后轉(zhuǎn)錄水平改良條斑紫菜品質(zhì)奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 序列獲取

miRBase 21.0數(shù)據(jù)庫（http://www.mirbase.org/）[6]下載所有植物miRNAs及其前體序列（pre-miRNAs），去除冗余后形成miRNA搜索序列。Genbank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 和 Rfam（http://rfam.sanger.ac.uk）數(shù)據(jù)庫[13]分別下載已公布條斑紫菜的SRA和RNA數(shù)據(jù)，作為miRNA模板序列。從文獻(xiàn)下載已公布條斑紫菜的miRNAs相關(guān)信息數(shù)據(jù)。Genbank數(shù)據(jù)庫下載紫菜mRNAs和ESTs用于條斑紫菜miRNA靶基因預(yù)測。

1.2 應(yīng)用軟件

序列比對軟件應(yīng)用BLAST 2.2.24（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）[14]。用 MFOLD（http:∥mfold.rna.albany.edu/）結(jié)合 Mireap（http://sourceforge.net/projects/mireap/）在線預(yù)測pre-miRNA二級結(jié)構(gòu)[15-16]。用 psRNATarget（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）預(yù)測miRNA對其靶標(biāo)的抑制方式[17]。Target-Finder（http://targetfinder.org/）預(yù)測 miRNA潛在的靶基因。miRNA保守性用Clustal W（http://www.clustal.org/clustal2/）[18]結(jié)合 WebLoGO（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）在線工具進(jìn)行分析[19]，miRNA 前體的系統(tǒng)進(jìn)化樹用Clustal W結(jié)合MEGA 5.0（https://www.megasoftware.net/）進(jìn)行構(gòu)建[20]。

1.3 條斑紫菜miRNA成熟體預(yù)測

將miRNA搜索序列（22 431條pye-ESTs）與miRNA模板序列（已公布植物miRNAs）進(jìn)行序列聯(lián)配及BLAST比對，根據(jù)以下原則對條斑紫菜miRNAs序列進(jìn)行篩選[21]：（1）錯配堿基數(shù)不超過3 個；（2）百分比不超過（L-4＋m）/L，其中，L是長度（堿基數(shù)），m是不一致的堿基數(shù)；（3）去除tRNA和rRNA及蛋白編碼序列；（4）（A＋U）占比30%～70%。

1.4 條斑紫菜miRNA前體預(yù)測

為進(jìn)一步確認(rèn)預(yù)測的條斑紫菜miRNA成熟體序列是否為條斑紫菜miRNAs，還須對其前體序列及二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。據(jù)統(tǒng)計，植物pre-miRNA序列長度約（144.57±56.91）nt[22]。以成熟體序列為核心，上下游序列各延伸120 nt作為pre-miRNA預(yù)測的源序列。根據(jù)以下原則預(yù)測pre-miRNA二級結(jié)構(gòu)[23]：（1）5′和 3′端不超過 2 nt的懸掛；（2）loop 或泡狀凸起大小不超過4 nt；（3）miRNA和 miRNA*必須位于“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)的一條臂上；（4）最小折疊自由能（MFE）不超過 -75.3 kJ/mol；（5）錯配堿基數(shù)不超過4；（6）miRNA成熟體與其互補(bǔ)鏈間無loop或gap現(xiàn)象。符合以上原則即可確定為條斑紫菜miRNAs。

1.5 條斑紫菜miRNA靶基因預(yù)測

將條斑紫菜miRNAs與紫菜ESTs及mRNAs進(jìn)行BLASTn比對，根據(jù)以下原則預(yù)測miRNA靶標(biāo)序列[24]：（1）錯配堿基數(shù)不超過 4 個；（2）2～12 位點間錯配堿基數(shù)不超過1個，其中，10～11位點間無堿基錯配；（3）在位點13～21之間錯配堿基數(shù)不超過4個，且不能有 2個連續(xù)的錯配堿基；（4）pre-miRNA具有最低的MFE和最高M(jìn)FEI。獲得miRNA靶標(biāo)序列后，根據(jù)miRNA靶標(biāo)的9～11 nt位點間是否完美互配，預(yù)測miRNA是否為切割抑制方式。BLASTp結(jié)合Pfam數(shù)據(jù)（http://pfam.sanger.ac.uk/）[25]，預(yù)測并分析miRNA靶基因及其功能。

1.6 條斑紫菜miRNAs的保守性與miR164s系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用序列聯(lián)配分析條斑紫菜已公布miRNAs的保守性，搜索保守性較高的區(qū)域，繪制條斑紫菜miRNA保守序列圖譜。根據(jù)條斑紫菜已公布的pre-miRNAs，以貝葉斯算法[26]構(gòu)建包含條斑紫菜在內(nèi)的所有植物miR164s系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析各miR164s間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，推測潛在的miR164基因家族。

2 結(jié)果與分析

2.1 條斑紫菜miRNAs及其前體序列特征分析

根據(jù)植物miRNA成熟體序列的保守性，本研究從15條候選序列中共預(yù)測到5條新的條斑紫菜miRNAs（表1），篩選率為33.3%。由表1可知，預(yù)測miRNAs的長度為21，22 nt，符合植物miRNA長度標(biāo)準(zhǔn)[27]。預(yù)測的條斑紫菜miRNAs前體序列的（A＋U）含量百分比在19.1%～57.1%，基本符合植物miRNA的AU堿基含量占比[21]。前體序列二級結(jié)構(gòu)均呈典型的莖環(huán)狀，成熟體序列均位于一條臂上，其中，3條位于5′端，2條位于3′端。前體序列長度在 136～293 nt，平均 209 nt，大于動物（70～80 nt）的長度[22]。有研究表明，為維持miRNA前體構(gòu)型的穩(wěn)定性，其二級結(jié)構(gòu)的MFE值應(yīng)小于-75.3 kJ/mol，MFEI值應(yīng)不小于0.85[22]。本研究獲得的條斑紫菜pre-miRNAs的 MFE 值在 -76.6～-128.6 kJ/mol，MFEI值在1.46～3.87，均符合pre-miRNA二級結(jié)構(gòu)的能量閾值要求（圖1）。綜合以上特征，本研究預(yù)測的條斑紫菜miRNAs信息基本可信。

表1 預(yù)測的條斑紫菜miRNAs信息

2.2 條斑紫菜miRNAs的保守性

根據(jù)本研究獲得的條斑紫菜miRNA數(shù)據(jù)結(jié)合LIANG等[7]和HE等[8]的數(shù)據(jù)，對條斑紫菜miRNAs的各位置堿基的偏好性進(jìn)行分析。由圖2-A可知，條斑紫菜miRNAs堿基體現(xiàn)了首尾偏好特征，首位堿基偏好U（符合植物miRNA首位堿基偏好）[10]，末位堿基偏好C，其余位置無明顯的堿基偏好性。將研究所得5條pye-miRNAs與已知植物miRNAs進(jìn)行序列聯(lián)配，結(jié)果顯示，條斑紫菜miR164c與其他10種植物間保守性較高，同源一致度達(dá)96.6%；此外，pye-miR8154 與 cpa-miR8154，pye-miR1095a與smo-miR1095a/b，pye-miR4993與 gma-miR4993-3p（圖2-B）的同源一致度均超過98%。研究結(jié)果證實了條斑紫菜與其他不同植物物種間miRNA成熟體序列的保守性特征。

2.3 條斑紫菜miRNA靶標(biāo)及其靶基因功能的預(yù)測

因植物中多數(shù)miRNAs幾乎與其靶標(biāo)位點嚴(yán)格地互補(bǔ)配對[28]，依此原則本研究共預(yù)測到pyemiRNAs的靶標(biāo)位點64個，其中，pye-miR4993-3p預(yù)測到的靶標(biāo)最多（58個），而pye-miR164c中未預(yù)測到任何靶標(biāo)位點（表2）。序列聯(lián)配分析結(jié)果表明，pye-miRNAs與其靶標(biāo)的錯配率僅為2.3%。psRNATarget預(yù)測pye-miRNAs對其靶基因的主要抑制類型為切割抑制。在細(xì)胞的特定部位，往往有某種蛋白質(zhì)的高豐度表達(dá)或者特異性表達(dá)[29]。根據(jù)miRNA靶基因注釋信息及蛋白質(zhì)序列比對結(jié)果，條斑紫菜中共預(yù)測到可靠的miRNA靶基因5條，功能涉及代謝和生長發(fā)育（表2），其余靶基因產(chǎn)物均為未知的假定蛋白，靶基因預(yù)測結(jié)果尚不能確定。

表2 預(yù)測的條斑紫菜miRNAs靶標(biāo)信息

2.4 條斑紫菜miR164的系統(tǒng)進(jìn)化

利用已預(yù)測條斑紫菜及已公布植物miR164前體序列，對條斑紫菜miR164在植物間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析。由圖3可知，所有pre-miR164s被明顯地分成2個大組。第一大組僅含有包括pye-premiR164c，zma-pre-miR164c 和 zma-pre-miR164h這3個pre-miR164基因家族子序列，表明三者間有較近的進(jìn)化距離及較低的堿基替代率。第二大組含有的pre-miR164基因家族成員數(shù)最多（116個家族成員），其又可分為4個亞組。第I亞組含44個pre-miR164s，分別屬于包括水稻、高粱、玉米、山羊草在內(nèi)的24個植物物種。第II亞組含41個pre-miR164s，分別屬于包括互葉梅、地黃、煙草、番茄在內(nèi)的23個植物物種。第III亞組含26個pre-miR164s，分別屬于包括蒺藜苜蓿、蕪菁、油菜、擬南芥在內(nèi)的13個植物物種。第IV亞組含6個pre-miR164s，分別屬于二穗短柄草、小麥、水稻、山羊草、玉米和高粱6個植物物種。由前體序列的進(jìn)化樹中可以看出，進(jìn)化樹整體較為分散，尤其是第二大組除可分為4個亞組外，各亞組又形成了各自的分支。從miR169s宿主物種分布來看，miR164s的進(jìn)化與物種進(jìn)化并不同步。有些親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種可以聚到同一分支上，如pye-pre-miR164c和zma-pre-miR164h/g；而同一物種的miR169家族成員之間卻相距較遠(yuǎn)，如玉米的6個miR164家族成員分布在除第二大組第III亞組外的其他各組中。

3 討論

目前，利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測紫菜miRNAs及靶標(biāo)是一種成本較低且便捷的研究手段，但該方法也存在序列篩選率低（本研究僅預(yù)測到5條新的pye-miRNAs）及必要的試驗驗證等缺陷。盡管pye-miRNAs分析結(jié)果表明其序列信息基本可信，但進(jìn)一步的實時定量RT-PCR[30]，RNA干擾[31]，基因過表達(dá)[32]或Northern blot[33]等仍有必要。為進(jìn)一步挖掘調(diào)控條斑紫菜特定功能的miRNA分子，不同控制條件下的小RNA文庫測序需繼續(xù)進(jìn)行。盡管基于第2代高通量測序技術(shù)的條斑紫菜miRNAs的鑒定已有報道[7-8]，但隨著第3代高通量測序技術(shù)的逐步完善，更豐富、更準(zhǔn)確的pye-miRNAs信息將被挖掘。

由于miR164s是植物中古老的、家族成員較多的保守miRNA基因家族[34]，考察條斑紫菜miR164在不同植物間的系統(tǒng)進(jìn)化地位很有必要。然而，研究結(jié)果顯示了miR164家族成員在不同植物間的多態(tài)性與隨機(jī)性特征，且與物種進(jìn)化不同步。這可能與不同植物基因組的復(fù)制事件以及miR164前體序列的產(chǎn)生（可產(chǎn)生于前體序列的5′或3′端）與自身的變異有關(guān)，表明了植物miRNA前體的復(fù)雜性，推測該家族的基因可能以不同的方式和速度進(jìn)化。

研究已證實，miR164s對擬南芥[35]、番茄[36]及水稻[37]的分生組織、輔助分生組織及葉緣鋸齒狀的形成起重要的調(diào)控作用。miR164的靶基因為CUC（Cup Shaped cotyledon）基因家族，控制植物器官分生與邊界的形成[38]。本研究未在條斑紫菜中鑒定到miR164靶基因，運用降解組測序及RACE的方法繼續(xù)對其靶基因進(jìn)行鑒定，將有利于條斑紫菜葉狀體形態(tài)形成的深入研究，為紫菜后轉(zhuǎn)錄水平的分子選育及其功能的開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

綜上，本研究將為條斑紫菜這一重要紫菜品種的資源保護(hù)與利用、后轉(zhuǎn)錄水平的品質(zhì)改良提供重要的參考。