生活飲用水中菌落總數(shù)和大腸埃希菌檢測能力驗證

林锏銳 龐曉林 丁秀瓊 鄭俏慧 劉驍 楊勁

1.中國檢驗認(rèn)證集團廣東有限公司湛江分公司廣東湛江524000；2.湛江海關(guān)(原湛江出入境檢驗檢疫局)

1 前言

實驗室能力驗證，是指利用實驗室間比對，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評價參加者的能力[1]。是為確保實驗室維持較高的校準(zhǔn)和檢測水平而對其能力進行考核、監(jiān)督和確認(rèn)的一種驗證活動。實驗室能力驗證可以確定實驗室進行某些特定的檢測能力，可以了解到新的檢測方法的有效性和可比性，可以利用評價數(shù)據(jù)對實驗室的質(zhì)量管理要素如檢測標(biāo)準(zhǔn)(方法)的確認(rèn)、儀器設(shè)備、人員技術(shù)能力、質(zhì)量控制情況進行分析[2]。2016年湛江檢驗檢疫局技術(shù)中心食品實驗室參加了中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心(ACAS)的生活飲用水中菌落總數(shù)和大腸埃希菌的檢測能力驗證，取得了滿意的結(jié)果。

2 材料與方法

2.1 待測樣品

ACAS-PT208“生活飲用水微生物指標(biāo)菌檢驗?zāi)芰︱炞C”樣品共兩瓶。棕色西林瓶內(nèi)裝白色凍干物，樣品標(biāo)識分別為:16-R152、16-M282；由ACAS提供。

2.2 主要培養(yǎng)基試劑

乳糖蛋白胨培養(yǎng)液(批號:160516)，EC-MUG培養(yǎng)基(批號:150410)，營養(yǎng)瓊脂(批號:160325)購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；胰蛋白大豆瓊脂(批號:5355937)，伊紅美藍瓊脂(EMB)(批號:5328983)，購自美國BD公司；革蘭氏陰性細菌鑒定卡(GN)(批號:241390440)購自法國生物梅里埃公司。

2.3 主要儀器設(shè)備

HFsafe-1500 LC型生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；GHP—9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；ZF-1B型三用紫外分析儀(上海汗諾儀器有限公司)；GR110DR型立式高壓蒸汽滅菌器(美國ZEALWAY)；VITEK2 Compact全自動微生物鑒定/藥敏分析系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司)；DM4B型leica數(shù)字顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司廣州分公司)。

2.4 檢驗方法

按照ACAS-PT208“生活飲用水微生物指標(biāo)菌檢測能力驗證”作業(yè)指導(dǎo)書和GB/T 5750.12-2006[3]的要求進行發(fā)酵、分離和鑒定。同時，采用全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)(VITEK2-Compact)進行菌株鑒定，綜合以上試驗結(jié)果出具報告。

2.5 操作步驟

菌落總數(shù)與大腸埃希菌均由兩名實驗員獨立完成，按照GB19489-2008《實驗室生物安全通用要求》與GB/T 5750.12-2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法微生物指標(biāo)》的要求進行。

2.5.1 樣品水化

樣品水化按照作業(yè)指導(dǎo)書說明進行。操作如下:樣品需要用220 mL無菌水進行水化，首先待待測樣品溫度恢復(fù)至室溫后，才可開啟樣品，開啟后立即加入20 mL無菌水進行水化；待溶解后吸出，移入無菌瓶中，再用余下的無菌水清洗西林瓶內(nèi)壁，回收清洗液移入上述無菌瓶中，此溶液即是待測水樣樣品。操作各環(huán)節(jié)應(yīng)保證無菌和充分混勻。

2.5.2 菌落總數(shù)測定

以無菌操作的方式從2.5.1中制備的220 mL待測水樣樣品(100稀釋液)中取出1 mL加入到9 mL滅菌生理鹽水試管中，充分混勻成10-1稀釋液，再從10-1稀釋液中取出1 mL加入到9 mL滅菌生理鹽水試管中，充分混勻成10-2稀釋液，按同法依次稀釋成10-3、10-4稀釋液；從100～10-4每個稀釋液中取出1mL分別加入到2個無菌平皿中，傾入約15mL已融化并冷卻到45℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并立即旋轉(zhuǎn)平皿，充分混勻。待培養(yǎng)基凝固后倒置放入36℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；24 h后取出讀數(shù)，再放回培養(yǎng)箱，48 h后再取出讀數(shù)。稀釋過程中制備每個稀釋液都需要更換新的滅菌玻璃吸管，同時以生理鹽水和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基做空白對照。

2.5.3 大腸埃希菌檢測(多管發(fā)酵法)

以無菌操作的方式從2.5.1中制備的220 mL待測水樣樣品(100稀釋液)中取出10 mL接種到10 mL雙料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，再依次從100～10-4稀釋液中取1 mL接種到10 mL單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，每一稀釋液接種5管。將接種管置于36℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24 h。如發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)氣，則用滅菌接種環(huán)將上述試管中的液體接種到EC-MUG管中。將已接種的EC-MUG管置于44.5℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24 h。再將培養(yǎng)后的EC-MUG管在暗處用波長366 nm，功率為6W的紫外燈照射。觀察是否有熒光。同時用接種環(huán)取產(chǎn)氣(無熒光)或有熒光的EC-MUG管1環(huán)，劃線接種于EMB平板，于36℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。從EMB平板上選取典型菌落進行革蘭氏染色、鏡檢。鏡檢符合的菌落再劃線接種于胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)平板，置于36℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。再進行IMViC試驗[5]，同時取TSA上菌落，用GN鑒定卡，按照GN卡試劑說明書制備測試菌液，并于VITEK2-Compact菌種鑒定系統(tǒng)上進行系統(tǒng)的生化鑒定。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌落總數(shù)

實驗采用雙人獨立操作，稀釋度范圍選取了100～10-45個稀釋度，結(jié)果見表1。兩位實驗員的樣品檢測結(jié)果基本一致，最終報告為16-R152:64 CFU/mL，16-M282:44 CFU/mL。Z值分別為:16-R152:-1.26，16-M282:-1.37，結(jié)果為滿意。

表1 菌落總數(shù)結(jié)果(CFU/mL)

3.2 大腸埃希菌

實驗選取了101～10-46個稀釋度。結(jié)果見表2。最終報告為16-R152:350MPN/100mL，16-M282:〈2MPN/100mL。Z值分別為:16-R152:0.00，16-M282:滿意，結(jié)果均為滿意。

4 小結(jié)

4.1 檢測準(zhǔn)備階段

4.1.1 人員和儀器的準(zhǔn)備工作

(1)檢測盡量安排兩位或以上的檢驗員獨立地進行檢測。在檢測開始前一定要先熟悉檢驗標(biāo)準(zhǔn)的每個細節(jié)。

(2)確保在檢測過程中所需的每部儀器都在儀器校準(zhǔn)的有效期內(nèi)并且可以正常使用。

4.1.2 培養(yǎng)基、生化試劑和菌株的準(zhǔn)備工作

(1)確保培養(yǎng)基和生化試劑在有效期內(nèi)并且沒有質(zhì)量問題。培養(yǎng)基可以進行性能測試，生化試劑可以用陽性菌株和陰性菌株進行測試。培養(yǎng)基和生化試劑盡量現(xiàn)配現(xiàn)用，如不能馬上使用的，要存放在適宜的環(huán)境中。在培養(yǎng)基配制過程中特別要注意試劑高壓滅菌后的pH值是否在適合范圍，如EC-MUG的pH值要在7～7.5[6]。接種前，各種培養(yǎng)基和生化試劑須預(yù)熱到培養(yǎng)溫度，避免樣品接種后在升溫過程中有雜菌生長，干擾結(jié)果判定。做好試劑空白，防止試劑問題影響實驗。如果是商品化培養(yǎng)基或者培養(yǎng)基配制時間較早，需要提前1～2 d放入培養(yǎng)基，在接種溫度下進行培養(yǎng)，觀察無菌生長后方可使用。

(2)盡量使用有證的標(biāo)準(zhǔn)菌株，并在合適的環(huán)境中進行保存。在實驗前進行活化并驗證其質(zhì)量是否存在問題。

4.2 檢測階段

4.2.1 接種方面的注意事項

(1)收到樣品后仔細閱讀作業(yè)指導(dǎo)書并嚴(yán)格按其說明進行操作，盡快開始檢驗。注意要耐心地對裝有樣品干粉的西林瓶進行多次潤洗。保證無殘留物在西林瓶內(nèi)。

(2)使用磁力轉(zhuǎn)子讓樣品保持均勻。接種的稀釋度盡可能地多，確保有合適稀釋度的菌落數(shù)在可計算范圍內(nèi)。在菌落總數(shù)方面，每一個稀釋度可以接種多于2個平板，防止個別平板因蔓延或其他原因不能讀數(shù)時，還可以保證讀數(shù)的準(zhǔn)確性。

(3)接種后盡快放入培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。

4.2.2 讀數(shù)方面的注意事項

(1)對于菌落總數(shù)，每天都觀察生長情況且預(yù)讀一次，防止平板里有蔓延的菌落，干擾讀數(shù)，影響結(jié)果。在最終讀數(shù)時，可以一個平板多人讀數(shù)，防止因個人的原因?qū)е碌穆┳x和錯讀。

(2)在大腸埃希菌方面，如果在觀察乳糖蛋白胨和EC-MUG管時有可疑情況，可適當(dāng)延遲培養(yǎng)時間，防止漏讀一些發(fā)酵較慢的菌。觀察EC-MUG熒光時也需要多人一起判定，防止一些熒光較弱的管被漏讀。必須做陰陽菌株對照，有利于結(jié)果的判定。無論EC-MUG有無熒光，都劃EMB和做后續(xù)的生化做為輔助判定。