黃粉蟲胚胎細(xì)胞原代培養(yǎng)研究

路婉茹, 徐紅偉, 喬自林, 令世鑫, 臧榮鑫, 比那兒·居瑪開勒德

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 蘭州 730030； 3.甘肅省動物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心， 蘭州 730030)

近年來，昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于昆蟲生理學(xué)、昆蟲病理學(xué)、昆蟲毒理學(xué)、分子遺傳學(xué)、發(fā)育學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)等領(lǐng)域。自1962年Grace建立桉蠶蛾(Anteraeaeucalypti)卵巢細(xì)胞系以來，特別是Smith等創(chuàng)建了昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Baculovius Expression Vector System,BEVS)之后，使得昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用得到了極大擴(kuò)展[1-3]。目前，在全世界建立的所有昆蟲細(xì)胞系中，大部分來源于鱗翅目和雙翅目，來源于鞘翅目昆蟲的細(xì)胞系僅占3% 左右[4]，而鞘翅目昆蟲應(yīng)用廣泛，與人類生活生產(chǎn)息息相關(guān)，多用于中藥、食品、營養(yǎng)物質(zhì)及化學(xué)物質(zhì)的提取等方面，有著重要的經(jīng)濟(jì)價值和藥用價值[5-8]，若建立更多來自鞘翅目的昆蟲細(xì)胞系，這將極大地推進(jìn)對鞘翅目昆蟲相關(guān)生物學(xué)的研究及應(yīng)用。

黃粉蟲(Tenebriomolitor)，又叫面包蟲，屬鞘翅目，擬步行蟲科，粉蟲甲屬。黃粉蟲是一類倉儲害蟲，其體內(nèi)蛋白質(zhì)含量豐富，可以作為許多動物的活餌料，還可作為人類的食品和保健品[9]。目前，有關(guān)黃粉蟲細(xì)胞的體外培養(yǎng)僅限于脂肪體細(xì)胞[10]，其他組織細(xì)胞的培養(yǎng)并未見報(bào)道。本研究以黃粉蟲蟲卵組織為原材料，開展了黃粉蟲胚胎組織原代細(xì)胞培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基、血清濃度以及胚胎發(fā)育時間的選擇研究，初步建立適合黃粉蟲胚胎組織原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑

供試黃粉蟲成蟲購于蘭州茂祥蔬菜保鮮有限公司。

Schneider′s昆蟲培養(yǎng)基購于SIGMA公司；Grace培養(yǎng)基和IPL-41培養(yǎng)基均購于GIBCO公司；澳洲胎牛血清(優(yōu)級)和優(yōu)級胎牛血清均購自蘭州民海生物工程有限公司；青鏈霉素、0.25% 胰蛋白酶-EDTA和臺盼藍(lán)染液均購自北京索來寶生物科技有限公司；兩性霉素購自生工生物工程(上海)股份有限公司；CCK-8 試劑盒購自同仁化學(xué)研究所。

1.2 黃粉蟲蟲卵的收集

將黃粉蟲成蟲置于底部鋪滿飼料的7～12目篩網(wǎng)上，25℃～28℃條件下，避光產(chǎn)卵；次日同一時間段，從飼料中用16～20目篩篩取蟲卵，然后剔除蟲卵中雜質(zhì)；在25℃～28℃條件下，孵化3～7 d，備用。

1.3 黃粉蟲胚胎組織原代細(xì)胞培養(yǎng)方法

1.3.1 胚胎組織的處理

參照Meng等[11]方法，取孵化7 d，顆粒飽滿蟲卵1000粒，無菌條件下，將蟲卵裹于雙層無菌紗布，先浸于10% 的NaClO溶液中消毒5～8 min，然后浸于75% 的酒精消毒5～6 min，接著用含至終濃度為200 U/mL青鏈霉素和2.5 μg/mL兩性霉素B的無菌水沖洗1～3次，最后再用培養(yǎng)基漂洗 1～2次。

1.3.2 機(jī)械分散法

將上述處理好的蟲卵轉(zhuǎn)移至孔徑100 μm的細(xì)胞篩，并將細(xì)胞篩置于培養(yǎng)皿(60 mm)中，加入8～10 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，用滅菌的橡膠頭充分研磨卵粒，然后吸取2.5 mL細(xì)胞濾液移入裝有2.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液的T-25 cm2培養(yǎng)瓶，分別用Grace、IPL-41和Schneider′s昆蟲培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，且該3種培養(yǎng)液中均添加青鏈霉素100 U/mL和20% 胎牛血清，細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于28℃普通培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔7～14 d更換60%～80% 的細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.3.3 胰酶消化法

將蟲卵搗碎后用雙層無菌紗布過濾，加入0.25% 胰蛋白酶-EDTA溶液，在室溫條件下消化5～10 min，然后加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化。以1000 r/min離心10 min，棄上清，將細(xì)胞沉淀重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液中，移入含5 mL培養(yǎng)液的細(xì)胞瓶，分別用Grace、IPL-41和Schneider′s昆蟲培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，且該3種培養(yǎng)液中均添加青鏈霉素100 U/mL和20% 胎牛血清，細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于28℃普通培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔7～14 d更換60%～80% 的細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.4 Grace培養(yǎng)基血清濃度篩選

按照機(jī)械分散法培養(yǎng)黃粉蟲胚胎原代細(xì)胞，參照李慧等[12]的方法，實(shí)驗(yàn)組每孔添加5%、10%、15%和20% 4種不同濃度梯度滅活的胎牛血清的Grace培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，以只添加Grace培養(yǎng)基的孔為空白組，Grace培養(yǎng)基加細(xì)胞為對照組，培養(yǎng)于4塊96孔板內(nèi)，每組3個重復(fù)，細(xì)胞密度均為2×104個/mL，100 μL/孔，培養(yǎng)周期為28 d。每隔7 d取出1板細(xì)胞，然后向每孔加入10 μL CCK-8溶液，并置于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2.5 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度值。以空白組調(diào)零，對照組細(xì)胞活力設(shè)定為100%，各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活力的大小是通過其各組的吸光度值與對照組相比較計(jì)算得到。通過對比同一時間段不同濃度FBS培養(yǎng)的細(xì)胞活力大小，從而篩選出適于黃粉蟲胚胎細(xì)胞原代培養(yǎng)的FBS濃度。

1.5 黃粉蟲蟲卵發(fā)育時間的選擇

選取孵化24、36、48、60、72、96、120、144和168 h的蟲卵各1000粒，按照機(jī)械分散法分別培養(yǎng)以上不同時間段內(nèi)的黃粉蟲胚胎組織原代細(xì)胞，通過觀察細(xì)胞生長狀態(tài)及其培養(yǎng)時間以及傳代情況，篩選出更適合用于黃粉蟲胚胎原代細(xì)胞培養(yǎng)的原材料。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間的方差分析采用One-way ANOVA 方法，多重比較采用LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 機(jī)械分散法及不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的原代胚胎組織細(xì)胞的生長狀態(tài)

1)使用Grace培養(yǎng)基培養(yǎng)黃粉蟲胚胎細(xì)胞24 h后，少量細(xì)胞團(tuán)組織貼壁，并從周圍遷移出細(xì)胞，極少部分單細(xì)胞貼壁，呈梭狀。72 h后，大部分組織團(tuán)塊貼壁，周圍遷移出的細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞內(nèi)分布少量顆粒及空泡(圖1-A)。15 d后，細(xì)胞貼滿整個瓶底(圖1-B)，進(jìn)行第一次傳代。采用胰酶消化法消化黃粉蟲胚胎原代細(xì)胞，消化約5 min，按體積比1∶1傳代。目前已傳至第5代。

2)使用IPL-41培養(yǎng)基培養(yǎng)黃粉蟲胚胎細(xì)胞24 h后，極少量組織塊貼壁，從周圍遷移出的細(xì)胞亦少，部分單細(xì)胞貼壁，多呈梭狀。72 h后，部分組織團(tuán)塊貼壁，周圍遷移出的細(xì)胞增多，細(xì)胞內(nèi)有顆粒，出現(xiàn)空泡。10 d后，大部分細(xì)胞貼壁。15 d后，從組織塊中遷移出的貼壁細(xì)胞開始變圓(圖1-C)，約2 d后，細(xì)胞開始脫落，懸浮于細(xì)胞液中，貼壁細(xì)胞逐漸減少，輕輕搖晃細(xì)胞瓶，貼壁的細(xì)胞組織脫落。

3)使用Schneider′s培養(yǎng)基培養(yǎng)黃粉蟲胚胎原代細(xì)胞，24 h后，少量組織團(tuán)塊貼壁，從周圍遷移出細(xì)胞，少量單細(xì)胞貼壁，呈梭狀。72 h后，大部分組織塊貼壁，周圍遷移出大量細(xì)胞，邊緣輪廓清晰(圖1-D)。15 d后，細(xì)胞貼滿瓶底(圖1-E)，進(jìn)行第一次傳代。采用胰酶消化法消化黃粉蟲胚胎原代細(xì)胞，消化約5 min，按體積比1∶1傳代。傳代24 h后，少量細(xì)胞塊貼壁，約72 h后，貼壁細(xì)胞變圓開始脫落(圖1-F)。

2.2 胰酶消化法及不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的原代胚胎組織細(xì)胞的生長狀態(tài)

采用胰酶消化法消化黃粉蟲胚胎組織，其細(xì)胞團(tuán)塊在Grace、IPL-41和Schneider′s 3種培養(yǎng)基中生長狀態(tài)相似，24 h后，均呈胰島樣細(xì)胞團(tuán)貼壁生長[13]。用Grace培養(yǎng)基培養(yǎng)的胚胎細(xì)胞，72 h后，貼壁生長的細(xì)胞團(tuán)增多，但在其周圍并未遷移出細(xì)胞，10 d后，大量細(xì)胞團(tuán)貼壁，周圍遷移出少量細(xì)胞(圖2-A)，約17 d后，細(xì)胞團(tuán)部分脫落。用IPL-41培養(yǎng)基培養(yǎng)的胚胎細(xì)胞，72 h后，部分細(xì)胞團(tuán)貼壁，5 d后，大量細(xì)胞團(tuán)貼壁，但周圍沒有遷移出貼壁細(xì)胞，7 d后，細(xì)胞團(tuán)周圍遷移出梭狀細(xì)胞，部分單細(xì)胞貼壁，呈梭狀(圖2-B)，20 d后，細(xì)胞團(tuán)開始脫落。用Schneider′s培養(yǎng)基培養(yǎng)的胚胎細(xì)胞，72 h后，少量細(xì)胞團(tuán)貼壁，10 d后，少量細(xì)胞團(tuán)脫落，約15 d后，僅有少量細(xì)胞團(tuán)貼壁(圖2-C)。

圖1 用機(jī)械分散法及不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的黃粉蟲胚胎原代細(xì)胞生長形態(tài)

A:Grace′s培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h； B: Grace′s培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d; C:IPL-41培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d; D: Schneider′s培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h; E: Schneider′s培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d ; F: 第一次傳代后，Schneider′s培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h。標(biāo)尺 Scale bars=100 μm

圖2 用胰酶消化法及不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的黃粉蟲胚胎原代細(xì)胞生長形態(tài)Fig 2 Cellular morphology of Tenebrio molitor embryonic cells by trypsin digestion in different media

A:Grace′s培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d; B:IPL-41培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d; C: Schneider′s培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d。 標(biāo)尺 Scale bars = 100 μm

2.3 胎牛血清濃度對黃粉蟲胚胎原代細(xì)胞存活的影響

由圖3可知，Grace培養(yǎng)基20% FBS組黃粉蟲胚胎原代細(xì)胞在培養(yǎng)7、14、21和28 d時細(xì)胞活力和15%組、10%組、5%組及無血清組相比，均差異極顯著(P<0.01)，15% 組與無血清組差異顯著(P<0.05),10% 組與5% 組差異不顯著(P>0.05)，28 d時10% 組和5 % 組與無血清組差異均顯著(P<0.05)。綜上說明沒有血清則不利于黃粉蟲胚胎原代細(xì)胞生長，添加20% FBS生長較好。

圖3 不同胎牛血清濃度對黃粉蟲胚胎細(xì)胞活力影響Fig 3 Effects of different concentrations of fetal bovine serum on the cell viability of Tenebrio molitor embryonic cells

圖中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差; 柱上不同字母表示不同處理濃度間的差異顯著性(P<0.05， LSD 法)

2.4 黃粉蟲蟲卵的選擇

按照機(jī)械分散法分別接種孵化24、36、48、60、72、96、120、144和168 h黃粉蟲蟲卵胚胎組織細(xì)胞，24 h后，在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)孵化24、36和48 h的蟲卵所培養(yǎng)的胚胎原代細(xì)胞并不生長，細(xì)胞呈圓形且規(guī)格不一，散落在細(xì)胞瓶底，輕輕搖晃，細(xì)胞由原來的聚集狀態(tài)轉(zhuǎn)至分散。1個月后，細(xì)胞裂解，細(xì)胞液渾濁。孵化60 h和72 h(孵化3 d)的蟲卵接種的胚胎原代細(xì)胞，在72 h后細(xì)胞團(tuán)塊開始貼壁，并從周圍遷移出貼壁細(xì)胞。15 d后，大量組織塊貼壁，40 d后，細(xì)胞長滿瓶底，進(jìn)行第一次傳代，目前已傳至第2代。孵化96 h(孵化4 d)的蟲卵接種的胚胎原代細(xì)胞，48 h后，組織塊少量貼壁，14 d后，細(xì)胞大量增殖，35 d后進(jìn)行第一次傳代，目前傳至第3代。孵化120 h和孵化144 h的蟲卵接種的胚胎原代細(xì)胞，與孵化96 h的卵相似，但并未傳代成功。孵化168 h(孵化7 d)的蟲卵接種的胚胎原代細(xì)胞目前已傳至第5代。

2.5 黃粉蟲胚胎原代細(xì)胞形態(tài)觀察

黃粉蟲孵化3～7 d蟲卵接種的胚胎原代細(xì)胞形態(tài)大致相同，以孵化7 d蟲卵接種的胚胎細(xì)胞形態(tài)予以說明。黃粉蟲胚胎組織在培養(yǎng)24 h后，組織團(tuán)塊開始貼壁，并在其周圍遷移出細(xì)胞，大部分為梭形，有的則呈現(xiàn)不規(guī)則形，游離單細(xì)胞貼壁呈梭形。7 d后，大量細(xì)胞團(tuán)塊貼壁，周圍遷移出的細(xì)胞生長迅速，有呈網(wǎng)狀排列的梭形細(xì)胞群(圖4-A)，有的則為一整片無規(guī)則的薄層細(xì)胞(圖4-B)。有極少數(shù)小細(xì)胞團(tuán)遷移出的細(xì)胞呈長條形放射狀排列(圖4-C)。有一些貼壁的細(xì)胞呈圓形有大、中、小3類,在光學(xué)顯微鏡下呈較亮與較暗兩類(圖4-D); 還有的貼壁的細(xì)胞呈三角形(圖4-E)、梭形(圖4-F)、蝌蚪形(圖4-G)、多角形(圖4-H)和長條形細(xì)胞(圖4-F)。一些細(xì)胞體表面出現(xiàn)氣泡(圖4-I)，邊緣模糊，在培養(yǎng)后期逐漸消失。 15 d左右，細(xì)胞貼滿細(xì)胞瓶壁，此時主要以梭形細(xì)胞為主。

圖4 黃粉蟲胚胎原代培養(yǎng)中的各種形態(tài)細(xì)胞Fig 4 Cellular morphology of the primary cells of the cultured Tenebrio molitor embryonic cell

A: 網(wǎng)狀排列細(xì)胞; B: 薄層細(xì)胞; C: 長條放射狀細(xì)胞; D: 圓形細(xì)胞; E: 三角形細(xì)胞; F: 梭形細(xì)胞; G:蝌蚪樣細(xì)胞; H 多角型細(xì)胞; I: 細(xì)胞充滿氣泡。 標(biāo)尺 Scale bars = 100 μm

3 討論與結(jié)論

3.1 黃粉蟲胚胎細(xì)胞的培養(yǎng)方法

本研究分別采用機(jī)械消化法和胰酶消化法以及3種不同的昆蟲培養(yǎng)基對黃粉蟲胚胎原代細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，選擇適合進(jìn)行原代胚胎細(xì)胞培養(yǎng)的孵化卵粒，比對4種不同濃度的FBS，其中采用機(jī)械消化法消化3 d至7 d孵化蟲卵的胚胎組織在Grace培養(yǎng)基中能夠更好地生長。

原代培養(yǎng)分離細(xì)胞一般包括機(jī)械分散法和酶解離細(xì)胞法。借助篩網(wǎng)分離細(xì)胞，該法可減少由于機(jī)械引起的對細(xì)胞帶來的損傷，屬較溫和的機(jī)械分散法[14]。但并不能避免由于機(jī)械作用而產(chǎn)生大量細(xì)胞碎片。胰酶消化法通過消化細(xì)胞間質(zhì)，組織塊在胰酶的消化作用下產(chǎn)生更多的游離細(xì)胞，但由于消化時間不易控制、組織塊消化時間過長，或胰酶濃度過高，造成對細(xì)胞損害加深，反而不利于培養(yǎng)。本試驗(yàn)采用篩網(wǎng)對黃粉蟲胚胎組織進(jìn)行分離并取得了良好的效果，可能是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)初期細(xì)胞需要適應(yīng)體外新的環(huán)境，而組織塊可以提供原代細(xì)胞生長的微環(huán)境，增強(qiáng)對外界的適應(yīng)能力[15]。

3.2 培養(yǎng)基及胎牛血清濃度的選擇

本試驗(yàn)分別選擇Grace、IPL-41和Schneider′s 3種昆蟲培養(yǎng)基對黃粉蟲胚胎原代細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)初期細(xì)胞均能在3種培養(yǎng)基中生長，隨著培養(yǎng)時間加長，細(xì)胞對每種培養(yǎng)基的適應(yīng)能力不同，培養(yǎng)效果出現(xiàn)差異。Grace培養(yǎng)基是目前應(yīng)用最廣的昆蟲培養(yǎng)基，可用于多種昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)[16-17]；IPL-41培養(yǎng)基最初用于草地貪夜蛾細(xì)胞系的培養(yǎng)，經(jīng)過改良也可用于其它昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)[18]；而Schneider′s培養(yǎng)基主要用來培養(yǎng)果蠅細(xì)胞系。通過培養(yǎng)，細(xì)胞在Grace培養(yǎng)基中生長狀況最好，而在IPL-41培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞在未長滿瓶底時就已脫落，裂解，說明該培養(yǎng)基并不適合用來培養(yǎng)黃粉蟲胚胎原代細(xì)胞，細(xì)胞在Schneider′s培養(yǎng)基生長良好但在第一次傳代后出現(xiàn)脫落， 無法進(jìn)行后續(xù)傳代。

通過在Grace培養(yǎng)基中添加4種不同濃度滅活的胎牛血清，測定黃粉蟲胚胎原代細(xì)胞在不同濃度下的細(xì)胞活力。結(jié)果表明，在Grace培養(yǎng)基20% FBS組黃粉蟲胚胎原代細(xì)胞在培養(yǎng)7、14、21和28 d時細(xì)胞活力和15%組、10%組、5%組及無血清組相比，均差異極顯著(P<0.01)，15% 組與無血清組差異顯著(P<0.05),10% 組與5% 組差異不顯著(P>0.05)，28 d時10% 組和5% 組與無血清組差異均顯著(P<0.05)。由此可見，F(xiàn)BS濃度越大，細(xì)胞活力越強(qiáng)，在培養(yǎng)基中添加20% FBS細(xì)胞生長最好。

3.3 黃粉蟲蟲卵發(fā)育時間的選擇

胚胎發(fā)育成一個完整的個體是通過細(xì)胞分裂增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移等一系列在分子水平和細(xì)胞水平的有序調(diào)控及相互作用下形成的。細(xì)胞分化程度越低則分化潛能越大。胚胎發(fā)育早期細(xì)胞分化程度較低，所以細(xì)胞培養(yǎng)效果更好。但在本研究中，孵化早期的卵所接種的細(xì)胞卻沒有培養(yǎng)成功，在倒置顯微鏡下觀察很難發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞團(tuán)或組織塊，在長達(dá)2個月的培養(yǎng)過程中僅有極個別纖維樣細(xì)胞貼壁，大部分在后期裂解。發(fā)育早期的胚胎還沒有形成組織器官的分化，在消毒或研磨過程中受到損傷較大，可能無法用來進(jìn)行原代培養(yǎng)[19]。蟲卵孵化60 h后接種的細(xì)胞在原代培養(yǎng)過程中均能貼壁生長，直至傳代。關(guān)于孵化 5～6 d卵接種的細(xì)胞沒有傳代成功，可能與蟲卵卵粒品質(zhì)以及黃粉蟲成蟲產(chǎn)卵狀態(tài)有關(guān)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采產(chǎn)卵初期與后期孵化的卵并不能夠很好地進(jìn)行原代培養(yǎng)。

本實(shí)驗(yàn)采用機(jī)械分散法接種孵化7 d黃粉蟲蟲卵胚胎組織細(xì)胞在含20% FBS的Grace培養(yǎng)基中能夠快速增殖且生長狀態(tài)較好，目前已傳至第5代。