兒茶素抑制Aβ1-40的SH-SY5Y細(xì)胞毒性作用研究

劉彥霞, 王佳月, 戴雪伶, 孫雅煊

(北京聯(lián)合大學(xué) 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室, 北京 100191)

阿爾茨海默病(AD)是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，患者的認(rèn)知功能及記憶功能逐漸減退[1]。AD發(fā)病機制迄今仍不明確，其涉及的發(fā)病機制有多種: 中樞神經(jīng)遞質(zhì)代謝障礙、Aβ沉積、tau蛋白過度磷酸化、氧化應(yīng)激、鈣代謝平衡失調(diào)及基因突變等[2]。Aβ是由淀粉樣蛋白前體(APP)在β分泌酶和γ分泌酶的作用下裂解形成的肽，由39～43個氨基酸殘基組成。APP經(jīng)過β分泌酶和γ分泌酶的水解能夠產(chǎn)生Aβ1-40、Aβ1-42，研究發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)Aβ1-40的產(chǎn)生量高于Aβ1-42[3]。但后者比前者更容易聚集，觸發(fā)Aβ級聯(lián)反應(yīng)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，可溶性的寡聚Aβ神經(jīng)毒性比纖維狀的Aβ更大[4]。

目前淀粉樣蛋白級聯(lián)假說在 AD 發(fā)病機制研究中占據(jù)主導(dǎo)地位，該假說認(rèn)為Aβ是導(dǎo)致阿爾茨海默病的主要原因。然而，至今還沒有以Aβ為靶點安全有效的藥物[5-6]。近些年，自然界中生物活性物質(zhì)以其生理活性強且毒副作用小而受到關(guān)注，如姜黃素、大蒜素、殼寡糖及兒茶素等[7-9]。兒茶素類物質(zhì)存在于許多植物中，如茶葉、葡萄中含量尤為豐富。已有大量研究證實兒茶素有諸多生理功能，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤等[10-11]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示攝入富含兒茶素的食物能夠降低神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率[12]，但兒茶素的作用機制尚不清楚，可能涉及對Aβ神經(jīng)毒性的抑制作用。

神經(jīng)母細(xì)胞瘤 SH-SY5Y 細(xì)胞，分化程度較低，其形態(tài)及生理功能類似于正常的神經(jīng)細(xì)胞[13]。本研究建立Aβ1-40損傷SH-SY5Y 細(xì)胞的模型，對兒茶素抑制Aβ1-40的細(xì)胞毒性作用進行研究，為兒茶素在神經(jīng)系統(tǒng)疾病預(yù)防方面的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

細(xì)胞系與藥物 SH-SY5Y細(xì)胞購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院；Aβ1-40(純度98.58%,吉爾生化)、兒茶素(≥98%,中國藥物與生物制品鑒定所)、二甲基亞砜(DMSO)購于Sigma；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購于Invitrogen 公司；乳酸脫氫酶(LDH)活性測劑盒、活性氧(ROS)檢測試劑盒、Bradford蛋白含量檢測試劑盒及Caspase 3活性檢測試劑盒購于碧云天公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇之后，放置于溫度為37℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。所用培養(yǎng)基構(gòu)成為：1640培養(yǎng)基+10%小牛血清(V/V)+1%鏈霉素-青霉素溶液(V/V)，每2～3 d進行一次傳代，藥物處理組使用不含血清的培養(yǎng)基。

1.2.2 藥物配制

將兒茶素溶于DMSO中，配制成濃度為10 mmol/L的母液，-20℃保存，實驗中用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。將1.8 mg Aβ1-40溶于600 μL六氟異丙醇中，超聲15 min，充分溶解，分裝為7管，然后在氮吹儀下吹干，-20℃保存。臨用時溶于600 μL純水中， 37℃孵育 24 h，用無血清培養(yǎng)基將藥物稀釋至需要濃度。

1.2.3 細(xì)胞存活率測定方法

細(xì)胞的生存能力采用 MTT法進行測定，按0.8×104個細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度于96孔板中培養(yǎng)，每孔中完全培養(yǎng)基體積為100 μL，培養(yǎng)24 h后加入藥物處理，培養(yǎng)一定時間后，每孔加入1/10體積(10 μL) 濃度為5 mg/mL 的MTT溶液 (終濃度為 0.5 mg/mL)，于 37℃含 5% CO2的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，然后小心將每孔中的培養(yǎng)基吸取出來，在每孔中加入 DMSO 150 μL，用移液槍輕輕吹打，使得甲瓚結(jié)晶充分溶解。在酶標(biāo)儀上選定波長 562 nm(參比波長 630 nm)，測定每孔 OD 值，計算各組細(xì)胞的存活率。

1.2.4 乳酸脫氫酶活性測定方法

乳酸脫氫酶是一種糖酵解胞質(zhì)酶，能催化乳酸生成丙酮酸。在細(xì)胞膜受到損傷的情況下，乳酸將會由細(xì)胞質(zhì)被釋放到培養(yǎng)液中[14-15]。乳酸脫氫酶活性檢測原理為：乳酸脫氫酶的作用能夠?qū)⑷樗岷?NAD還原，生成丙酮酸與 NADH， NADH 與INT(2-p-iodoph enyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride)在硫辛酰胺脫氫酶(diaphorase)的進一步催化下，生成 NAD+與強生色物甲臜(formazan，其最大吸收波長為 490 nm)，此物質(zhì)的吸光強度與樣品中 LDH 的含量成正比。實驗中將SH-SY5Y細(xì)胞按 0.8×104個細(xì)胞/孔的密度種植于 96 孔板中，加藥處理，然后測定細(xì)胞培養(yǎng)液中 LDH 的含量，比較不同處理組間的相對吸光強度。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的測定方法

此方法是利用熒光密度法來檢測細(xì)胞內(nèi) ROS的水平，其檢測原理為：二氯二氫熒光素二乙酸酯(Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate, DCFH-DA)可以自由穿過細(xì)胞膜，DCFH-DA本身雖然沒有熒光，但是當(dāng)其進入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解，生成不能自由透過細(xì)胞膜的二氯二氫熒光素(Dichloro-dihydro-fluorescein, DCFH)。而細(xì)胞內(nèi)的 ROS可以氧化本無熒光性的DCFH， 產(chǎn)生具有熒光特性的二氯熒光素(Dichloro-fluorescein, DCF)，通過檢測 DCF 的熒光密度就可以檢測出細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。SH-SY5Y細(xì)胞按 0.8×104個細(xì)胞/孔的密度種植于96 孔板中，于37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。藥物處理后，加入 DCFH-DA 探針(終濃度為 10 μmol/L)，孵育0.5 h之后，用 PBS 清洗 3 次，然后加入無酚紅培養(yǎng)液，在熒光顯微鏡下 485 nm 波長激發(fā)，記錄 530 nm 處的熒光光密度值，比較不同組相對光密度值。

1.2.6 Caspase 3活性檢測方法

Caspase蛋白酶家族在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用， Caspase 3是細(xì)胞凋亡過程中的一個關(guān)鍵酶[16]。Caspase 3的檢測原理為：Caspase 3可以催化底物Ac-DEVD-pNA(acetyl-Asp-Glu-Val-Aspp-nitroanilide)，產(chǎn)物為呈現(xiàn)黃色的pNA (p-nitroanilide)，pNA在波長為405 nm附近有較強吸收，所以通過測定波長405 nm處的吸光度來檢測pNA的生成量，即代表Caspase 3的活性。本實驗將SH-SY5Y細(xì)胞按 5×105個細(xì)胞/孔的密度培養(yǎng)于 6 孔板中，藥物處理后，按照試劑盒要求提取總蛋白，用Bradford法測定蛋白濃度，檢測不同處理組在405 nm波長下的吸收值，計算各處理組Caspase 3的相對活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

結(jié)果均采用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計處理，每個樣品至少測3次，每次5個重復(fù)。不同藥物處理的顯著性差異采用單因素方差分析(ANOVA)和Duncan檢驗。顯著差異水平設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度DMSO對細(xì)胞存活率的影響

兒茶素溶于水，但在冷水中溶解度較低，所以本實驗采用DMSO作為其助溶劑，并對其對細(xì)胞存活率的影響進行了研究。由圖1可見，隨DMSO濃度的增加，細(xì)胞存活率表現(xiàn)出劑量依賴性降低。DMSO濃度在0.05%時，細(xì)胞存活率為(100.12±12.70)%，略高于對照，但無顯著性差異。DMSO濃度為0.1%時，細(xì)胞存活率為(91.36±7.31)%，與空白無顯著差異。濃度為0.15%時，細(xì)胞存活率為(81.75±7.30)%，當(dāng)濃度為0.2%、0.25%時細(xì)胞存活率分別為(63.05±4.82)%和(52.93±2.27)%，顯著低于空白。故選擇DMSO濃度0.1%進行后續(xù)實驗。

2.2 Aβ?lián)p傷濃度的選擇

本試驗對Aβ處理后，采用不同濃度的Aβ(0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5和20 μmol/L) 作用于SH-SY5Y細(xì)胞，用MTT法對細(xì)胞存活率進行檢測，選擇合適的Aβ細(xì)胞損傷濃度。根據(jù)圖2可以看出，在設(shè)置的0.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5和20.0 μmol/L各組不同濃度Aβ處理組中，當(dāng)Aβ作用濃度為10.0 μmol/L及以上時，與對照組相比存在顯著差異 (P<0.05)。本實驗中選取10.0 μmol/L Aβ進行后續(xù)實驗。

圖1 不同DMSO濃度對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響Fig 1 Effect of DMSO concentration on cell viability of SH-SY5Y

“*”表示與空白組相比有顯著性差異(P<0.05)；“**”表示與空白組相比有顯著性差異(P<0.01)

圖2 不同Aβ濃度對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響Fig 2 Effect of Aβ concentration on cell viability of SH-SY5Y

“*”表示與空白組相比有顯著性差異(P<0.05)

2.3 兒茶素不同作用濃度對細(xì)胞存活能力的影響

兒茶素是一種具有抗氧化活性的物質(zhì)，但作為一種外源物質(zhì)，其本身對于細(xì)胞的存活能力是否有影響？本實驗采用MTT檢測法對不同濃度兒茶素(0、2.5、5、10、20、40、80和100 μmol/L)對SH-SY5Y細(xì)胞的存活能力的影響進行測定，結(jié)果如圖3所示：從2.5至80 μmol/L各兒茶素處理組與對照之間細(xì)胞存活能力均無顯著性差異，而100 μmol/L兒茶素處理組細(xì)胞的存活率較對照組顯著降低(P<0.05)。后續(xù)實驗采用兒茶素5和10 μmol/L兩個作用濃度進行。

圖3 不同兒茶素濃度對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響Fig 3 Effect of Catechin concentration on cell viability of SH-SY5Y

“*”表示與空白組相比有顯著性差異(P<0.05)

2.4 兒茶素對Aβ?lián)p傷SH-SY5Y細(xì)胞存活能力的影響

預(yù)先用兒茶素保護細(xì)胞4 h后，用10 μmol/L Aβ?lián)p傷細(xì)胞，24 h后用MTT法檢測細(xì)胞的存活率，結(jié)果如圖4所示：10 μmol/L Aβ使細(xì)胞的存活率顯著下降(P<0.01)，而5和10 μmol/L兒茶素預(yù)處理組細(xì)胞存活率較Aβ處理組有所提高。表明兒茶素對于Aβ所造成的SH-SY5Y細(xì)胞損傷具有預(yù)保護作用。

圖4 兒茶素對Aβ?lián)p傷SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響Fig 4 Protection of Catechin on cell viability of SH-SY5Y damaged by Aβ

“*”表示與空白組相比有顯著性差異(P<0.05)；“**”表示與空白組相比有顯著性差異(P<0.01)；#表示與Aβ處理組之間有顯著差異(P<0.05)

2.5 兒茶素對Aβ?lián)p傷SH-SY5Y細(xì)胞LDH釋放的影響

乳酸脫氫酶是一種糖酵解胞質(zhì)酶，在細(xì)胞膜損傷情況下，乳酸由細(xì)胞質(zhì)被釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液中[15]。由圖5可知，10 μmol/L Aβ處理后的細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的釋放量顯著高于對照(P<0.01)，5 μmol/L兒茶素預(yù)處理組LDH的釋放量相對于10 μmol/L Aβ處理組明顯減少(P<0.05)，10 μmol/L兒茶素預(yù)處理組LDH的釋放量與10 μmol/L Aβ處理組相比沒有顯著下降，但數(shù)值有所減小，表明兒茶素能夠降低Aβ對SH-SY5Y細(xì)胞膜的損傷。

2.6 兒茶素對Aβ?lián)p傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS自由基產(chǎn)生的影響

Aβ?lián)p傷可能會導(dǎo)致細(xì)胞的有氧代謝加強，致使細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的升高[17]。兒茶素類物質(zhì)含有多個酚羥基，可以作為供氫體與ROS及其他自由基結(jié)合，終止鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，減輕氧化損傷。由實驗結(jié)果(圖6)可知，10 μmol/L Aβ處理后的細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生量顯著高于對照(P<0.01)，5 μmol/L及10 μmol/L兒茶素預(yù)處理組ROS的產(chǎn)生量相對于10 μmol/L Aβ處理組明顯減少(P<0.01)。兒茶素可能通過抗氧化作用抑制了Aβ所誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，降低了細(xì)胞ROS水平，從而提高了細(xì)胞的存活率。Ban在利用兒茶素保護Aβ25-35所誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中也得到同樣的效果[18]。

圖5 兒茶素對Aβ?lián)p傷SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生LDH的影響Fig 5 Effect of Catechin on LDH released by SH-SY5Y damaged by Aβ

“*”表示與空白組相比有顯著性差異(P<0.05)；“**”表示與空白組相比有極顯著性差異(P<0.01)；#表示與Aβ?lián)p傷組之間有顯著性差異(P<0.05)

圖6 兒茶素對Aβ?lián)p傷SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響Fig 6 Effect of Catechin on ROS produced by SH-SY5Y damaged by Aβ

**表示與空白組相比有極顯著性差異(P<0.01)； ## 表示與10 μmol/L Aβ處理組之間有顯著差異(P<0.01)

2.7 兒茶素對Aβ?lián)p傷SH-SY5Y細(xì)胞Caspase 3活性的影響

Caspase 家族是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵元件，其激活與超常表達均引起細(xì)胞凋亡，因此又稱死亡蛋白酶，可通過與眾多蛋白因子的相互作用調(diào)控細(xì)胞凋亡[16]。Caspase-3 處于凋亡有序級聯(lián)反應(yīng)的下游，是最重要的效應(yīng)型 Caspase，是 Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，是細(xì)胞凋亡過程中的主要效應(yīng)因子，是多種凋亡刺激信號傳遞的匯聚點，它的活化是凋亡進入不可逆階段的標(biāo)志[16]。本實驗中，10 μmol/L Aβ處理后的細(xì)胞caspae 3的活性顯著高于對照(P<0.05)，5 μmol/L及10 μmol/L兒茶素預(yù)處理組caspae 3的活性相對于10 μmol/L Aβ與對照沒有顯著差異(圖7)。 表示兒茶素可能通過抑制細(xì)胞凋亡途徑而削弱了Aβ所誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性,與Ruan在對兒茶素保護進行研究時得到的結(jié)果一致[19]。

圖7 兒茶素對Aβ?lián)p傷SH-SY5Y細(xì)胞caspase3 酶活力的影響Fig 7 Effect of Catechin on caspase 3 activity produced by SH-SY5Y damaged by Aβ

“*”表示與空白組相比有顯著性差異(P<0.05)

3 結(jié)論

根據(jù)實驗所得結(jié)果，一定濃度的Aβ1-40處理能夠?qū)е耂H-SY5Y細(xì)胞的存活能力下降，加劇細(xì)胞膜的通透性，并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，細(xì)胞凋亡通路中關(guān)鍵蛋白Caspase 3的活性增強。而兒茶素類物質(zhì)的預(yù)保護，能夠抑制由Aβ1-40所導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞生存能力的下降以及細(xì)胞膜通透性的降低。這可能與兒茶素的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，兒茶素類物質(zhì)的多羥基結(jié)構(gòu)，尤其是B環(huán)鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)使其具有強抗氧化活性，能夠清除自由基、螯合金屬離子，從而緩解細(xì)胞內(nèi)氧化壓力。同時，兒茶素可能還通過對細(xì)胞凋亡途徑中關(guān)鍵蛋白活性的調(diào)節(jié)來減少細(xì)胞死亡。