改造代謝途徑生產(chǎn)芳香族氨基酸衍生物的研究進展

鄭振坤，王彩蕓，劉 文

(青島科技大學 化工學院，山東 青島 266042)

芳香族氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的衍生物中，許多都是具有生物活性的天然產(chǎn)物。比如酪氨酸和苯丙氨酸可作為嗎啡、可待因等藥物的前體，又比如長春花堿、喜樹堿等化療藥物可以色氨酸為前體進行生產(chǎn)。

這些具有高價值的芳香族氨基酸衍生物可由生物自然產(chǎn)生，但其工業(yè)化生產(chǎn)卻不理想。因為天然生物提取法收率低，操作復雜；而且化合物復雜的結構造成其化學合成和商業(yè)化的困難[1]。合成生物學研究是在功能基因組學、計算生物學和系統(tǒng)生物學等基礎上，將工程化理念應用在生物學中，定向創(chuàng)造新型生物產(chǎn)品和生物過程整體優(yōu)化的新的研究方向[2]。在微生物中重建生物合成途徑，利用其代謝工程進行發(fā)酵生產(chǎn)高價值化合物的方法受到越來越多的關注。許多芳香族產(chǎn)品的生產(chǎn)仍處于初級階段，許多有價值的產(chǎn)品只重構了部分路徑。在這里，我們將討論一下這些重建產(chǎn)品的一些最新進展。

1 白藜蘆醇

白藜蘆醇是一種芪類化合物，廣泛存在于多種植物中。作為一種抗氧化劑，白藜蘆醇具有心臟保護、抗腫瘤和神經(jīng)保護功能。此外，它還具有潛在的抗衰老功能。作為一種功能性營養(yǎng)品，白藜蘆醇具有非常廣闊的市場前景。

白藜蘆醇可以由酪氨酸或苯丙氨酸作為初始原料，在酵母中合成。孫萍等[3]利用降落-重疊延伸PCR法和一步等溫法，將擬南芥的4-香豆酰輔酶A連接酶基因(4cl)、巨峰葡萄的白藜蘆醇合酶基因(rs)以及粘紅酵母的酪氨酸解氨酶基因(tal)分別構建含有不同抗性篩選標記的附加型酵母表達載體，轉化釀酒酵母工業(yè)型菌株，最終發(fā)酵液中白藜蘆醇的產(chǎn)量為6.1979 mg/L。但是合成培養(yǎng)基中白藜蘆醇的濃度仍然相當?shù)?。另一項研究比較了使用富營養(yǎng)培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基對白藜蘆醇產(chǎn)量的影響，表明使用富營養(yǎng)培養(yǎng)基大大提高了白藜蘆醇的產(chǎn)量，用工業(yè)巴西甘蔗發(fā)酵，酵母生產(chǎn)的白藜蘆醇濃度高達391 mg/L[4]。

利用大腸桿菌表達生產(chǎn)白藜蘆醇也是可行的。朱屹東[5]以一株苯丙氨酸高產(chǎn)大腸桿菌菌株(酪氨酸缺陷型)為出發(fā)菌株，敲除了AroF基因和PheA基因，表達抗反饋抑制的tyrAfbr基因，同時將白藜蘆醇合成的必須基因TAL、4CL、STS整合至大腸桿菌基因組上，構建了一株強化了酪氨酸合成的白藜蘆醇生產(chǎn)菌株。在以葡萄糖為底物進行發(fā)酵培養(yǎng)后，檢測到白藜蘆醇產(chǎn)量達到了71.6 mg/L，相比全質(zhì)粒體系的基因工程菌產(chǎn)量提高了20.3倍。林雅楠[6]使用攜帶大腸桿菌組成型強啟動子的質(zhì)粒，無需加入誘導劑，保證了酶的表達和安全性，使白藜蘆醇的產(chǎn)量達到0.6g/L。

2 芐基異喹啉生物堿

芐基異喹啉類生物堿(BIAs)是一類具有重要研究及藥用價值的次生代謝產(chǎn)物，目前該類生物堿主要來源于植物，由酪氨酸衍生，包括嗎啡、可待因、非洲防己堿、小檗堿、血根堿等。異喹啉類生物堿的生物合成途徑開始于2種酪氨酸衍生物多巴胺和4-羥基苯乙醛的縮合，緊接著是一系列的反應形成反式牛心果堿，反式牛心果堿是大部分生物堿普遍的前體物質(zhì)。

由于缺乏關鍵的生物合成步驟知識，只有部分途徑能夠重建，且要對中間體進行投料，導致許多BIAs的生產(chǎn)被限制。例如Mimami等[7]報道，使用共培養(yǎng)的大腸桿菌和酵母，重建部分途徑，生產(chǎn)阿樸菲生物堿木蘭堿 (7.2 mg/L)和原小檗堿生物堿斯氏紫堇堿(8.3 mg/L)。Hawkins 等[8]將(R,S)-全去甲勞丹堿轉換成 (R,S)-牛心果堿，產(chǎn)量為164.5 mg/L。最近，F(xiàn)ossati等[9]報道了用(R,S)-全去甲勞丹堿生產(chǎn)二氫血根堿的10個基因的途徑的重建，向包含所有酶的酵母菌株投料(R,S)-全去甲勞丹堿得到1.5%的二氫血根堿轉換率。

3 類黃酮

類黃酮是一類從高等植物中提取的多酚類次生代謝產(chǎn)物，在植物中廣泛存在，具有抗氧化和自由基清除活性，可以調(diào)節(jié)機體免疫力、抗病毒、抗癌、保護神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)，是目前高端功能性營養(yǎng)化學品的代表。

柚皮素是許多黃酮類化合物的一種常見的前體，由苯丙氨酸或酪氨酸經(jīng)數(shù)個生物合成步驟合成。吳俊俊[10]利用從頭設計原則異位重構了黃酮骨架物質(zhì)生物合成途徑，結果大腸桿菌可以利用葡萄糖合成生松素和柚皮素的產(chǎn)量分別達到2.2 mg/L和4.5 mg/L。這類研究成為微生物生產(chǎn)類黃酮的一個重要的發(fā)展，可能為柚皮素的重要下游產(chǎn)品的生產(chǎn)鋪平道路。例如，最近有人成功將根皮素(一種矯味劑)在大腸桿菌中由柚皮素經(jīng)查耳酮異構酶和烯酮還原酶表達合成[11]。

4 展望

我們討論了微生物代謝工程生產(chǎn)芳香族氨基酸衍生物領域的一些近展，然而其中還有許多未攻克的難點，主要障礙是許多有價值的化合物缺乏完整的生物合成途徑信息，所以重建整個生物合成途徑尚是一個挑戰(zhàn)。但我們相信，隨著合成生物學的發(fā)展，越來越多的工具和方法被應用，生物代謝途徑的研究也會更多元化，也將有更多的研究成果被應用于人類社會的生產(chǎn)和生活。

[1]De Luca V,Salim V，Atsumi S M，et al.Mining the biodiversity of plants：a revolution in the making[J].Science，2012，336：1658-1661.

[2]申曉林，袁其朋.生物合成芳香族氨基酸及其衍生物的研究進展[J].生物技術通報，2017，33(1)：24-34.

[3]孫 萍，郭麗瓊，黃佳俊，等.釀酒酵母工程菌生物合成白藜蘆醇[J].中國食品學報，2016，16(3)：68-74.

[4]Sydor T，Schaffer S，Boles E.Considerable increase in resveratrol production by recombinant industrial yeast strains with use of rich medium[J].Applied and Environmental Microbiology，2010，76：3361-3363.

[5]朱屹東.代謝工程改造大腸桿菌生產(chǎn)白藜蘆醇[D].無錫:江南大學，2016.

[6]林雅楠.重組大腸桿菌生物合成白藜蘆醇的條件研究[D].濟南:齊魯工業(yè)大學，2013.

[7]Minami H，Kim J S，Ikezawa N，et al.Microbial production of plant benzylisoquinoline alkaloids[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105：7393-7398.

[8]Hawkins K M，Smolke C D.Production of benzylisoquinoline alkaloids in Saccharomyces cerevisiae[J].Nat Chem Biol，2008，4：564-573.

[9]Fossati E，Ekins A，Narcross L，et al.Reconstitution of a 10-gene pathway for synthesis of the plant alkaloid dihydrosanguinarine in Saccharomyces cerevisiae[J].Nature Communications，2014，5：3283.

[10]吳俊俊.合成生物技術改造大腸桿菌生產(chǎn)黃酮骨架物質(zhì)[D].無錫:江南大學，2015.

[11]Gall M，Thomsen M，Peters C，et al.Enzymatic conversion of flavonoids using bacterial chalcone isomerase and enoate reductase[J].Angewandte Chemie (International ed.in English)，2014，53：1439-1442.