美洛昔康片對(duì)比格犬的靶動(dòng)物安全性評(píng)價(jià)

林 紅，徐恩民，鄭 莉，馮言言，孟 芳，孔 梅，吳連勇

(1.齊魯動(dòng)物保健品有限公司，濟(jì)南250100；2.山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，濟(jì)南250022)

美洛昔康[1]是一種新型烯醇酰胺類的非甾體類抗炎藥物(Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug，NSAID)，作用機(jī)制主要是抑制前列腺素(Prostaglandins，PGs)環(huán)氧化酶，阻止花生四烯酸轉(zhuǎn)化為PGs而發(fā)揮抗炎、止痛和解熱作用，而且毒副反應(yīng)小。袁占奎等[2]報(bào)道，股骨頭切除術(shù)是寵物臨床上常見的手術(shù)，可繼發(fā)骨關(guān)節(jié)炎等，其手術(shù)過程中及術(shù)后恢復(fù)期均會(huì)對(duì)犬產(chǎn)生很大的疼痛應(yīng)激。李凱年報(bào)道，骨關(guān)節(jié)炎[3]是犬的一種退行性骨關(guān)節(jié)疾病，也是犬的一種比較多發(fā)的疾病。李彥等報(bào)道，犬髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良(Canine Hip Dysplasia CHD)是一種以遺傳性為基礎(chǔ)的后天發(fā)育畸形，是由多種病因?qū)е碌膹?fù)合性疾病。炎癥和疼痛是其臨床適應(yīng)癥之一。美洛昔康作為一類常用的NSAID，在臨床上廣泛用于骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多種發(fā)熱和各種疼痛癥狀的緩解，與其他非甾體類抗炎藥相比，嚴(yán)重胃腸道等不良反應(yīng)的發(fā)生率明顯降低。

美洛昔康于2000年6月獲FDA批準(zhǔn)，用于緩解骨關(guān)節(jié)炎癥狀。德國Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc作為原研廠家，F(xiàn)DA和歐盟先后批準(zhǔn)了多家公司生產(chǎn)的美洛昔康注射液、口服溶液、片劑等一系列產(chǎn)品，從批準(zhǔn)上市以來，在靶動(dòng)物犬等獸醫(yī)臨床上廣泛應(yīng)用，未見不良反應(yīng)報(bào)道。通過本研究可了解比格犬對(duì)美洛昔康片的臨床不良反應(yīng)和中毒劑量對(duì)犬的組織病理學(xué)和生理生化指標(biāo)的影響，提出美洛昔康片的不良反應(yīng)、防治措施及臨床應(yīng)用時(shí)的注意事項(xiàng)，以確保臨床用藥的安全性。

1 材料與方法

1.1 受試藥物和試劑 美洛昔康片，規(guī)格2.5 mg/片；批號(hào)：1307002，由齊魯動(dòng)物保健品有限公司提供。生理生化分析配套試劑，結(jié)晶紫染液，中性紅染液，蒸餾水等。

1.2 儀器設(shè)備 ARCO PC型全自動(dòng)生化分析儀，意大利BIOTECNICA公司；Hemastar II型血液分析儀，法國Yoder公司；RM2235切片機(jī)，德國萊卡公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 三色健康比格犬24只，12～16月齡，體重11.4～14.2 kg左右，雌雄各半，由北京海淀區(qū)蘇家坨比格犬試驗(yàn)場提供。所有比格犬均已經(jīng)多聯(lián)苗免疫和驅(qū)蟲處理?；A(chǔ)日糧不含任何藥物添加劑，飼養(yǎng)籠內(nèi)封閉式飼養(yǎng)，自由采食和飲水。

1.4 試驗(yàn)分組及給藥[4]將比格犬隨機(jī)分成4個(gè)組，每組6只，雌雄各半，試驗(yàn)前預(yù)飼7 d，臨床觀察健康后，各試驗(yàn)組犬按試驗(yàn)設(shè)計(jì)給藥，試驗(yàn)周期21 d。每日上午8點(diǎn)給藥，試驗(yàn)分組及給藥如表1。

表1 試驗(yàn)分組及給藥Tab 1 The test group and drug administration

1.5 試驗(yàn)檢測指標(biāo)

1.5.1 采食量、日增重及飼料轉(zhuǎn)化率 在試驗(yàn)開始給藥前(0 d)和最后一次給藥后(給藥第7天)分別按組別稱量犬只體重，稱重均在早晨空腹進(jìn)行，同時(shí)記錄各組犬的采食量，計(jì)算平均日耗料量，進(jìn)而計(jì)算其飼料轉(zhuǎn)化率(耗料/增重)。

1.5.2 臨床表現(xiàn)(大小便、外觀行為，體溫、呼吸頻率和脈搏) 試驗(yàn)前觀察一周，觀察犬的行為、活動(dòng)、飲水、攝食、毛發(fā)、精神、體重等，穩(wěn)定后進(jìn)行試驗(yàn)。整個(gè)試驗(yàn)期，每日于給藥后觀察并記錄各組犬的健康狀況和臨床表現(xiàn)(大小便、外觀行為、體溫、呼吸頻率和脈搏等)，記錄死亡數(shù)，并計(jì)算各組的死亡率和成活率。一般觀察：每天上午和下午給藥后觀察記錄犬的一般體征，并于給藥前測定犬的體溫、呼吸頻率和脈搏，發(fā)現(xiàn)有反應(yīng)的犬重點(diǎn)觀察。

1.5.3 血液生理指標(biāo) 犬血液生理指標(biāo)委托動(dòng)物醫(yī)學(xué)院國家獸藥安全評(píng)價(jià)中心進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測分析。在試驗(yàn)開始給藥前(0 d)、給藥后3 d和最后一次給藥后7 d對(duì)各組犬進(jìn)行臂頭靜脈采血，進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)等血液生理指標(biāo)測定。

1.5.4 血液生化指標(biāo) 犬血液生化指標(biāo)委托動(dòng)物醫(yī)學(xué)院國家獸藥安全評(píng)價(jià)中心進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測分析。在試驗(yàn)開始給藥前(0 d)、給藥后3 d和最后一次給藥后7 d對(duì)各組犬進(jìn)行臂頭靜脈采血，進(jìn)行丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、血糖(GLU)、總膽紅素(TBIL)等血液生化指標(biāo)測定。

1.5.5 大體剖檢 對(duì)試驗(yàn)過程中的死亡犬，以及試驗(yàn)結(jié)束后全部5×推薦劑量組和空白對(duì)照組(必要時(shí)包括3×推薦劑量組)的犬進(jìn)行安樂死，進(jìn)行大體剖檢。

1.5.6 組織病理學(xué)檢查 對(duì)于空白對(duì)照組和5×推薦劑量組犬實(shí)施安樂死，分別取心臟、肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、胃等組織進(jìn)行固定、包埋，使用切片機(jī)進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，之后進(jìn)行H.E.染色和組織病理學(xué)檢查。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理 用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS14.0進(jìn)行方差分析和X2(卡方)檢驗(yàn)分析各組之間的日增重、飼料轉(zhuǎn)化率、血液生理生化指標(biāo)的差異顯著性。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極其顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 各劑量組犬采食量、日增重及飼料轉(zhuǎn)化率比較 藥物對(duì)動(dòng)物體重的影響：整個(gè)試驗(yàn)期間，空白對(duì)照組、1×推薦劑量組和3×推薦劑量組、5×推薦劑量組比格犬體重增加無明顯影響，體重隨時(shí)間延長而增加，與空白對(duì)照組犬相比差異不顯著(P>0.05)，說明連續(xù)大劑量給予美洛昔康片不會(huì)較大程度改變動(dòng)物體重，對(duì)飼料轉(zhuǎn)化率影響不大，說明動(dòng)物的機(jī)體代謝水平仍維持在正常生理狀態(tài)。結(jié)果見表2。

表2 各組比格犬在給藥前后的采食量、日增重和飼料轉(zhuǎn)化率Tab 2 Food intake, weight gain, feed conversion ratio of beagle dogs in each group before and after treatment

2.2 各劑量組犬臨床表現(xiàn)(體溫、脈搏和呼吸頻率)比較 對(duì)所有比格犬連續(xù)給藥7 d期間，觀察其行為未見異常、活動(dòng)自如、皮毛光亮、口眼鼻耳無分泌物、攝食飲水正常、大便正常、尿顏色正常，未見任何明顯毒副作用，也未發(fā)現(xiàn)動(dòng)物死亡。不同組別比格犬體溫、脈搏和呼吸頻率均在正常參考值范圍之內(nèi)，見圖A～圖C。

2.3 各劑量組犬血液生理、生化指標(biāo)比較 血液學(xué)指標(biāo)檢查：在試驗(yàn)開始給藥前(0 d)、給藥后3 d和最后一次給藥后7 d的采血進(jìn)行血液學(xué)生理指標(biāo)檢查，結(jié)果表明：試驗(yàn)組與對(duì)照組犬血液學(xué)指標(biāo)均在犬正常生理指標(biāo)范圍之內(nèi)，因此未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(表3～表5)。

血清生化指標(biāo)檢查：在試驗(yàn)開始給藥前(0 d)、給藥后3 d和最后一次給藥后7 d進(jìn)行血清生化指標(biāo)檢查，數(shù)據(jù)采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算各指標(biāo)的平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果表明：試驗(yàn)組與對(duì)照組生化指標(biāo)均在正常范圍之內(nèi)，之間無顯著差異(見表6～表8)。

圖A 各組比格犬給藥后不同時(shí)間點(diǎn)體溫情況Fig A Body temperature of dogs at different time after treatment

圖B 各組比格犬給藥后不同時(shí)間點(diǎn)脈搏情況Fig B Pulse of dogs at different time after treatment

圖C 各組比格犬給藥后不同時(shí)間點(diǎn)呼吸頻率情況Fig C Respiratory rate of dogs at different time after treatment

表3 各組比格犬在試驗(yàn)開始給藥前(0 d)時(shí)血液生理指標(biāo)值Tab 3 Hematology index value of beagle dogs before treatment(day 0)

表4 各組比格犬在給藥后3 d時(shí)血液生理指標(biāo)值Tab 4 Hematology index value of beagle dogs after treatment(day 3)

表5 各組比格犬在最后一次給藥后(7 d)時(shí)血液生理指標(biāo)值Tab 5 Hematology index value of beagle dogs after treatment(day 7)

續(xù)表

表6 各組比格犬在試驗(yàn)開始給藥前(0 d)時(shí)血液生化指標(biāo)值Tab 6 Biochemistry parameters value of beagle dogs before treatment(day 0)

表7 各組比格犬在給藥后3 d時(shí)血液生化指標(biāo)值Tab 7 Biochemistry parameters value of beagle dogs after treatment(day 3)

表8 各組比格犬在最后一次給藥后(7 d)時(shí)血液生化指標(biāo)值Tab 8 Biochemistry parameters value of beagle dogs after treatment(day 7)

2.4 空白對(duì)照組和5×推薦劑量組犬大體剖檢結(jié)果

從正常比格犬與5×推薦劑量組比格犬大體剖檢來看，心包膜和心臟、肺臟、脾臟、肝臟、腎臟等，被膜顏色正常，臟器表面無異常，邊緣整齊，無出血點(diǎn)或壞死病癥，說明5×推薦劑量連續(xù)給藥7 d對(duì)犬臟器無肉眼可見的不良影響。

2.5 空白對(duì)照組和5×推薦劑量組犬組織病理學(xué)檢查結(jié)果

2.5.1 空白對(duì)照組犬不同組織病理學(xué)觀察 組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照犬的各個(gè)主要內(nèi)臟器官結(jié)構(gòu)完整清晰，可作為對(duì)照使用。

2.5.2 5 ×推薦劑量組犬組織病理學(xué)觀察 對(duì)采集的6只5×推薦劑量犬的心臟、肺臟、肝臟、腎臟、脾臟、胃(共6種)組織進(jìn)行固定、包埋，使用切片機(jī)進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，之后進(jìn)行H.E.染色，其結(jié)果見表9。

表9 5×推薦劑量組犬組織病理學(xué)觀察結(jié)果Tab 9 Histopathological observation of dogs of 5 times recommended dosage group

經(jīng)觀察可見，該犬心肌纖維排列致密整齊，心肌細(xì)胞細(xì)胞核完整(圖D)；肝臟有一定程度的肝細(xì)胞空泡化(圖E)；肺臟的肺泡壁完整，肺泡腔內(nèi)透亮(圖F)；脾臟結(jié)構(gòu)清晰，可見脾小梁、白髓區(qū)的脾小結(jié)、中央動(dòng)脈和紅髓區(qū)的血竇等結(jié)構(gòu)(圖G)；腎小管管腔中有絮狀物質(zhì)沉著(圖H)；胃黏膜上皮細(xì)胞上有炎性物質(zhì)滲出(圖I)。

圖D 19號(hào)犬心臟(40X)Fig D Heart of No.19 dog(40X)

圖E 20號(hào)犬肝臟(40X)Fig E Liver of No.20 dog(40X)

圖F 21號(hào)犬肺臟(40X)Fig F Lung of No.21 dog(40X)

圖G 22號(hào)犬脾臟(10X)FigG Spleen of No.20 dog(40X)

圖H 22號(hào)犬腎臟(40X)Fig H Kidney of No.22 dog(40X)

圖I 23號(hào)犬胃(10X)Fig I Stomach of No.23 dog(40X)

3 討論與結(jié)論

原研單位報(bào)道了6～8月齡的比格犬使用美洛昔康后的安全性，將犬隨機(jī)分成4組，首次皮下注射0、0.2、0.4、0.6 mg/kg bw的美洛昔康注射液，然后按0.1mg/kg bw劑量每天內(nèi)服美洛昔康混懸液，連用6 d。觀察并記錄犬的臨床癥狀、體重、采食和飲水量，7 d后所有犬進(jìn)行尸體剖檢。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，犬未表現(xiàn)臨床不良反應(yīng)，體重、采食量、飲水量未受影響；第4 d對(duì)照組的一只母犬和第5天中劑量組的一只公犬的糞便測定為潛血陽性，其他樣品均為陰性，這與該品種和年齡犬的預(yù)期情況一致。血液生理學(xué)和生化參數(shù)中未發(fā)現(xiàn)與臨床治療有關(guān)的變化。尸檢時(shí)，胃腸道中未觀察到潰瘍和出血；治療前后，犬表現(xiàn)短暫的胃腸道癥狀，如嘔吐、糞便變軟和腹瀉，這與EMA的報(bào)道一致，但因清洗期也出現(xiàn)了類似癥狀，因此認(rèn)為這與治療無關(guān)。綜上說明美洛昔康在犬注射和內(nèi)服應(yīng)用的安全性較高。美洛昔康片作為內(nèi)服劑型，經(jīng)試驗(yàn)證明其與內(nèi)服混懸液是生物等效的，推斷美洛昔康片在犬應(yīng)用是安全的。

劉宏[5]研究了美洛昔康片對(duì)犬的安全性。試驗(yàn)選取24只10 kg左右的健康中華田園成年犬，公母各半，隨機(jī)分為4組，每組6只。試驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組(0 mg/kg bw)、臨床推薦劑量組(0.1 mg/kg bw)、3倍臨床推薦劑量組(0.3 mg/kg bw)、5倍臨床推薦劑量組(0.5 mg/kg bw)。每天給藥1次，連續(xù)給藥28 d。通過與劉宏的研究發(fā)現(xiàn)，給藥7 d后，我們測定的紅細(xì)胞數(shù)與其數(shù)據(jù)一致，但白細(xì)胞數(shù)量偏低，這可能與所用試驗(yàn)動(dòng)物的種類不同有關(guān)，但都在正常生理范圍內(nèi)，且正常生理范圍值一致。血液生化測定指標(biāo)中，1、3、5倍的天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的測定結(jié)果雖然略有差別，但與空白對(duì)照組相比，都有升高的趨勢。這兩個(gè)試驗(yàn)結(jié)果都表明，犬服用美洛昔康片后各項(xiàng)生理生化指標(biāo)均在正常生理范圍內(nèi)，說明其臨床應(yīng)用是安全的。

袁震[6]報(bào)道了美洛昔康口服液對(duì)犬的安全性評(píng)價(jià)，首次劑量加倍，從第二天開始劑量減半，每天一次，連用5 d，給藥后第7 d與其第6 d的測定結(jié)果相比，無論是生理指標(biāo)中的紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)，還是生化指標(biāo)中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和總蛋白(TP)的測定結(jié)果均在試驗(yàn)犬的正常生理范圍內(nèi)，且與對(duì)照組相比，差異均不顯著。

本研究表明，美洛昔康片按推薦劑量使用，對(duì)靶動(dòng)物犬是安全的。