高效液相色譜法測(cè)定板藍(lán)根顆粒中腺苷的含量

王亞芳，鐘昆芮，李應(yīng)超，周艷飛，張小飛，高 婷，秦俊杰，王海軍，戰(zhàn) 皓*

(1.北京市獸藥監(jiān)察所，北京 100107； 2.北京生泰爾生物科技有限公司，北京 102206； 3.北京市中獸藥工程技術(shù)研究中心，北京 102206)

板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort. 的干燥根，具有清熱解毒、涼血利咽的功效，主要包括吲哚類(lèi)、喹唑酮類(lèi)、芥子苷類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)和核苷類(lèi)等化合物[1-3]。板藍(lán)根顆粒由單味藥材板藍(lán)根經(jīng)提取、濃縮、加工而成，我公司根據(jù)《中國(guó)藥典》2015版一部中板藍(lán)根顆粒處方提取制備成便于臨床應(yīng)用的新獸用產(chǎn)品，清熱解毒，涼血利咽，用于治療雞傳染性法氏囊病，豬風(fēng)熱感冒等癥。獸用板藍(lán)根顆粒市場(chǎng)基數(shù)大，生產(chǎn)企業(yè)魚(yú)龍混雜，存有企業(yè)在原材料收購(gòu)、飲片加工和成藥生產(chǎn)過(guò)程中不規(guī)范環(huán)節(jié)，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，無(wú)法保證藥效，需要制定一種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)板藍(lán)根顆粒的產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行控制。

板藍(lán)根中核苷類(lèi)成分，尤其是腺苷，具有抗炎、抗凝血、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、松弛支氣管平滑肌、鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)和抗心律不齊的作用，可以通過(guò)參與并干擾細(xì)菌病毒的基因表達(dá)過(guò)程，從而起到一定的抗病毒作用[4-7]。《中國(guó)藥典》中僅以亮氨酸、精氨酸為對(duì)照作為定性鑒別項(xiàng)，無(wú)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。為了更好的控制板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量，本研究將活性成分腺苷作為指標(biāo)性成分，對(duì)其含量測(cè)定方法進(jìn)行研究，為進(jìn)一步完善板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器 Waters1525高效液相色譜儀，2487雙通道可調(diào)波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，美國(guó)waters公司；Symmetry C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，美國(guó)waters公司；KQ-500B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試藥 板藍(lán)根顆粒批號(hào)：080305、080307、080310、080312、080315、080317、080320、080322、080324、080326，北京生泰爾技術(shù)研究院試制產(chǎn)品；腺苷對(duì)照品，批號(hào)：110879-200202，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇(色譜純)；雙蒸水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Symmetry C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(10∶90)；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；流速：1.2 mL/min；柱溫：30℃。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 稱(chēng)取腺苷對(duì)照品約10 mg，精密稱(chēng)定，置50 mL的容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，濾過(guò)，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱(chēng)定2 g，置具塞三角瓶中，加20 mL水超聲處理15 min，取出，放置至室溫，過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取腺苷對(duì)照品儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋得到濃度分別為4、8、12、16、20 μg/mL的溶液，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)。按上述色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積。以腺苷濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果顯示腺苷濃度在4～20 μg/mL內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程y=71169x-6732，R2=0.9999。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取腺苷對(duì)照品溶液20 μL，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)過(guò)計(jì)算，RSD=0.06%，表明該方法精密度良好。

表1 精密度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果 (n=6)Tab 1 Precision test results (n=6)

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 稱(chēng)取板藍(lán)根顆粒粉末，在不同實(shí)驗(yàn)室分別由6個(gè)分析人員，平行制備6份供試品溶液，分別測(cè)定，根據(jù)峰面積值，計(jì)算腺苷含量及RSD值，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示腺苷平均含量為0.184 mg/g，RSD為1.50%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

表2 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 2 Reproducibility test results (n=6)

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按上述色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)峰面積值，計(jì)算腺苷含量及RSD值，見(jiàn)表3。結(jié)果顯示腺苷平均含量0.180 mg/g，RSD為0.43%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 2 Stability test results (n=6)

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的板藍(lán)根顆粒樣品6份，每份約1.0 g，精密稱(chēng)取，分別精密加入適量腺苷對(duì)照品，按上述樣品溶液制備方法和色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算腺苷的加樣回收率及RSD值，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示，腺苷的平均加樣回收率為96.62%(RSD=1.08%)。

表4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 4 Experimental results of recovery

2.9 樣品測(cè)定 取10批板藍(lán)根顆粒樣品，分別按上述樣品溶液制備方法和色譜條件，測(cè)定峰面積，計(jì)算腺苷含量和RSD值，含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5，色譜圖見(jiàn)圖1。由表5可知，板藍(lán)根顆粒中腺苷的含量為0.182 mg/g(RSD=1.52%)；圖1所得到的液相色譜圖峰型較對(duì)稱(chēng)，分離度高，保留時(shí)間適當(dāng)。表明該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好且穩(wěn)定。

表5 板藍(lán)根顆粒中腺苷含量測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab 5 Determination of adenosine content in Banlangen Granule(n=3)

(a：腺苷)(a: adenosine)圖1 腺苷對(duì)照品(A)及供試品溶液(B)色譜圖Fig 1 Chromatograms of adenosine(A)and sample(B)of Banlangen Granule

3 討論與結(jié)論

3.1 流動(dòng)相比例的考察 本研究分別考察了甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液以12∶88，10∶90 比例下的色譜效果。當(dāng)甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液比例為12∶88時(shí)，腺苷的保留時(shí)間為15.8min，但色譜峰容易受到雜質(zhì)峰干擾；將比例稍作調(diào)整，當(dāng)比例為10∶90時(shí)，腺苷保留時(shí)間為17.3 min，腺苷峰分離度高，故選擇流動(dòng)相為甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(10∶90)。

3.2 流速的考察 本研究分別以流速0.8、1、1.2 mL/min進(jìn)行優(yōu)選。當(dāng)流速為0.8 mL/min時(shí)，腺苷的保留時(shí)間為27.3 min，出峰較慢；當(dāng)流速為1.0 mL/min時(shí)，腺苷保留時(shí)間為20.9 min，出峰時(shí)間較理想，但有拖尾現(xiàn)象；當(dāng)流速為1.2 mL/min時(shí)，腺苷的保留時(shí)間為17.3 min，腺苷峰分離度高且保留時(shí)間適宜，故選擇流速為1.2 mL/min。

3.3 測(cè)定結(jié)果分析 本研究對(duì)10批板藍(lán)根顆粒樣品中腺苷的含量進(jìn)行了測(cè)定，由測(cè)定結(jié)果可知，同一批樣品腺苷含量較穩(wěn)定，且10批樣品腺苷含量范圍為 0.178～0.188 mg/g，表明板藍(lán)根顆粒制備方法穩(wěn)定、重復(fù)性能較好。同時(shí)，以相同制備方法和色譜條件對(duì)3個(gè)廠家的獸用板青顆粒中腺苷含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，腺苷含量范圍為0.006～0.098 mg/g，不同廠家樣品中腺苷含量差異顯著，其內(nèi)在質(zhì)量差異較為明顯。

本研究所建立的含量測(cè)定方法，腺苷與板藍(lán)根顆粒中其他組分可以得到較好的分離，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定且重復(fù)性良好，同時(shí)為板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量控制提供了一種新方法。此外，板藍(lán)根顆粒中有效成分眾多，如何更全面的反應(yīng)板藍(lán)根顆粒的內(nèi)在質(zhì)量，研究報(bào)道甚少，亦有待進(jìn)一步研究。