七氟烷對(duì)大鼠肺缺血再灌注損傷中ATM的影響

梁 燕 賈 珍 陳仲海 阿良德

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，青海 西寧 810001)

肺缺血再灌注損傷(LIRI)可并發(fā)于多種外科手術(shù)中，譬如心肺轉(zhuǎn)流、肺移植等，是術(shù)后早期導(dǎo)致呼吸功能障礙及死亡的重要原因〔1〕。LIRI發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，尚未完全闡明，目前認(rèn)為機(jī)體產(chǎn)生大量的氧自由基在LIRI病程發(fā)展中起主要作用。七氟烷(Sev)作為應(yīng)用于圍術(shù)期的麻醉藥，已證實(shí)其預(yù)處理和后處理對(duì)LIRI有保護(hù)作用，激活蛋白激酶(PK)C、核因子E2相關(guān)因子(Nrf)2、血紅素加氧酶(HO)-1信號(hào)通路，抑制自由基生成〔2，3〕，但其作用機(jī)制仍需深入研究。缺血再灌注(I/R)導(dǎo)致活性氧(ROS)上調(diào)，誘發(fā)DNA 損傷，在此過(guò)程中激活了自動(dòng)磷酸化蛋白激酶(ATM)，并啟動(dòng)下游多種信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和DNA修復(fù)。該進(jìn)程穩(wěn)定基因組，阻止錯(cuò)誤的遺傳信息傳遞到子代當(dāng)中。在其他類型研究中發(fā)現(xiàn)，ATM上調(diào)經(jīng)PKC激活細(xì)胞核內(nèi)Nrf2表達(dá)，從而啟動(dòng)抗氧化反應(yīng)元件(ARE)調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄，提高各種抗氧化酶的表達(dá)，例如HO-1和超氧化物歧化酶(SOD)等，清除自由基，減輕氧化損傷。本研究擬使用Sev后處理及ATM抑制劑KU-55933作用于LIRI老年大鼠模型，檢測(cè)ATM是否參與了Sev誘導(dǎo)的PKC和Nrf2表達(dá)提高。

1 材料與方法

1.1材料和儀器 清潔級(jí)Sprague Dawley(SD)成年大鼠，14周齡,450～500 g，雌雄各半，購(gòu)自青海省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；KU-55933由上海源葉公司合成；Sev購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；丙二醛(MDA)、SOD檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程公司；p-ATM、γ-H2AX、RKC、Nrf2、LaminA和GAPDH均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；二抗購(gòu)自武漢博士德公司；細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒購(gòu)自碧云天；小動(dòng)物呼吸機(jī)為上海奧爾科特生物科技公司產(chǎn)品。

1.2動(dòng)物分組 50只SD大鼠隨機(jī)分為5組，①假手術(shù)組(Sham組)；②肺I/R組(I/R組)；③ATM抑制劑KU-55933組(KU組)為缺血前10 min，按照5 mg/kg通過(guò)靜脈注射KU-55933；④Sev組為缺血操作后吸入2%體積的Sev 10 min，再經(jīng)10 min洗脫，然后再吸入2%體積Sev 10 min；⑤Sev后處理和KU-55933合并處理組(Sev/KU組)為缺血前靜脈注射KU-55933，缺血后兩次吸入Sev。大鼠手術(shù)完畢后即取肺部進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。

1.3大鼠LIRI模型制作 SD大鼠按照0.1 mg·kg-1·min-1劑量腹腔注射戊巴比妥，麻醉后仰臥位固定，行氣管插管，接小動(dòng)物呼吸機(jī)，按照10 ml/kg的100%氧氣(約呼吸70次/min)通氣量進(jìn)行機(jī)械通氣，麻醉機(jī)同呼吸機(jī)進(jìn)氣口相連。無(wú)菌條件下沿中線開(kāi)胸，切開(kāi)肌肉層和胸膜，暴露心臟和肺部，游離左肺門，缺血前于頸內(nèi)靜脈三通處按照1 mg/kg劑量注射肝素，靜息5 min后，于呼吸末用無(wú)創(chuàng)血管夾從右上側(cè)至左下側(cè)夾閉左肺門(包括左主支氣管、左肺動(dòng)、左肺靜脈)，阻斷45 min后松開(kāi)血管夾進(jìn)行血液和通氣再灌注，維持120 min，期間每隔1 h靜脈注射0.5 ml生理鹽水，用于維持體液平衡。再灌注結(jié)束后處死大鼠，留取標(biāo)本，-80℃保存。Sham組不阻斷左肺門，持續(xù)灌注180 min；Sev兩次吸入和洗脫于再灌注期間進(jìn)行；KU-55933注射于頸靜脈。

1.4肺濕/干重(W/D)比測(cè)量 取120 min再灌注左肺上半葉，稱重作為濕重(W)，再置于通風(fēng)80℃恒溫箱中烤72 h至恒重，稱量作為干重(D)，計(jì)算W/D。

1.5血清MDA和SOD測(cè)量 取120 min再灌注后大鼠心臟動(dòng)脈血，靜置后，離心分離，吸取上層血清，保存于-80℃，檢測(cè)時(shí)統(tǒng)一取出，按照試劑盒說(shuō)明書，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法，檢測(cè)血清MDA和SOD含量。

1.6免疫印跡檢測(cè) Nrf2、LaminA檢測(cè)肺組織細(xì)胞核內(nèi)水平，核蛋白提取按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行；p-ATM、γ-H2AX、PKC和GAPDH檢測(cè)鼠肺組織內(nèi)蛋白水平，肺組織勻漿后用裂解液聚氰基丙烯酸正丁酯裂解，10 000 r/min冰凍離心10 min，上清液用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法進(jìn)行蛋白定量，取等量蛋白用聚丙烯酰胺凝膠(SDS)電泳，并轉(zhuǎn)膜到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，用一抗4C過(guò)夜孵育，次日二抗室溫孵育2 h，然后用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑進(jìn)行顯色、定影，Epson1650Photo掃描儀收集圖像。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1KU-55933阻礙了Sev降低LIRI大鼠肺W/D的保護(hù)作用 I/R組出現(xiàn)肺水腫，W/D比值(5.32±0.18)較Sham組(4.21±0.24)明顯增加(P<0.05)，證明LIRI模型建立成功，KU組W/D比值(5.36±0.31)無(wú)明顯變化，Sev組W/D比值(4.68±0.23)較I/R組明顯降低(P<0.05)，降低肺水腫，但Sev/KU組W/D比值(5.01±0.24)較Sev組明顯升高(P<0.05)。與Sham組比較，其他4組W/D值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2MDA和SOD水平 同Sham組相比，I/R組SOD和MDA有明顯下降和升高，證明LIRI影響血清中SOD和MDA的表達(dá)，但同I/R組相比，KU組SOD有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，對(duì)MDA沒(méi)有影響，Sev組較I/R組SOD活性顯著升高和MDA含量顯著下降，Sev/KU組SOD和MDA水平同Sev組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3KU-55933抑制Sev上調(diào)的p-ATM和γ-H2AX LIRI導(dǎo)致肺組織中p-ATM和γ-H2AX表達(dá)上升，說(shuō)明大鼠肺對(duì)I/R呈現(xiàn)應(yīng)激性增加，而Sev應(yīng)用有利于p-ATM和γ-H2AX的持續(xù)升高，證實(shí)p-ATM通路的啟動(dòng)。但當(dāng)預(yù)處理KU-55933時(shí)，p-ATM和γ-H2AX增加程度略有下降，經(jīng)灰度掃描后，同Sev組相比，Sev/KU組p-ATM和γ-H2AX表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1和圖1。

2.4Sev上調(diào)PKC表達(dá)，KU-55933抑制上調(diào)的PKC 同Sham組相比，各組PKC均表達(dá)升高；同I/R組相比，Sev組中PKC明顯升高，而Sev/KU組明顯降低升高的PKC(P<0.05)。見(jiàn)表1和圖1。

2.5KU-55933部分抑制Sev上調(diào)的Nrf2 I/R組肺組織細(xì)胞核內(nèi)Nrf2表達(dá)應(yīng)激升高，經(jīng)Sev處理后，肺組織細(xì)胞核內(nèi)Nrf2進(jìn)一步增加，推測(cè)這種顯著上升有利于肺臟保護(hù)，清楚多余的自由基，但當(dāng)預(yù)處理ATM抑制劑KU-55933時(shí)，Nrf2增加程度略有下降，經(jīng)灰度掃描后，同Sev組相比，Sev/KU組Nrf2表達(dá)呈明顯下降(P<0.05)。見(jiàn)表1和圖1。

表1 各組血清SOD活性水平及MDA含量及肺組織p-ATM、γ-H2AX、PKC、Nrf2蛋白表達(dá)水平

與Sham組比較:1)P<0.05；與I/R組比較:2)P<0.05；與Sev組比較:3)P<0.05

圖1 各組肺組織p-ATM、γ-H2AX、PKC、Nrf2蛋白表達(dá)

3 討 論

LIRI可在多種外科臨床手術(shù)中發(fā)生，肺由于其氣體交換的功能特質(zhì)，較其他器官而言，對(duì)缺血有一定耐受性，但有害物質(zhì)仍舊產(chǎn)生；由于肺部具有豐富的微血管，再灌注時(shí)觸發(fā)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，出現(xiàn)肺部功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷的現(xiàn)象，導(dǎo)致肺水腫、肺出血、肺動(dòng)脈高壓等癥狀〔4〕。這一過(guò)程發(fā)生發(fā)展機(jī)制非常復(fù)雜，目前以氧自由基增多等氧化應(yīng)激的研究較為深入。

本研究發(fā)現(xiàn)，I/R損傷可以直接產(chǎn)生有害的自由基和過(guò)氧化脂類，降低SOD和升高M(jìn)DA水平，導(dǎo)致組織內(nèi)氧化還原反應(yīng)系統(tǒng)失衡和氧化應(yīng)激損傷，在該過(guò)程中，ATM、PKC、Nrf2信號(hào)通路被激活，從而啟動(dòng)下游抗氧化反應(yīng)，對(duì)抗過(guò)量生成的氧自由基。在缺血過(guò)程中吸入Sev時(shí)，可進(jìn)一步激發(fā)上述信號(hào)通路，啟動(dòng)更強(qiáng)烈的抗氧化反應(yīng)，而對(duì)ATM進(jìn)行抑制時(shí)，該信號(hào)通路中的PKC、Nrf2也受到抑制，揭示ATM參與了抗氧化應(yīng)激壓力過(guò)程。

LIRI發(fā)生時(shí)，大量生成的氧自由基產(chǎn)生毒性效應(yīng)，啟發(fā)膜脂質(zhì)過(guò)氧化，氧化各種蛋白呈失活狀態(tài)，以至于遺傳物質(zhì)的損傷〔5〕。膜脂質(zhì)過(guò)氧化使生物膜功能改變，影響膜上各種受體、通道蛋白的生物學(xué)功能，從而引起，胞內(nèi)信號(hào)傳遞和一系列細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)，如促凋亡、促炎和抗增殖等生物效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和臟器損傷〔6〕。輻射、化學(xué)試劑及I/R可升高細(xì)胞內(nèi)的氧化壓力，造成基因組的損傷，從而激活胞內(nèi)ATM通路及其相關(guān)的DNA修復(fù)反應(yīng)，如細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞老化或細(xì)胞程序性死亡，從而保證遺傳信息的穩(wěn)定傳遞。ROS誘導(dǎo)DNA損傷后，ATM激酶通過(guò)自磷酸化而激活，組成有活性的ATM二聚體〔7～9〕，進(jìn)一步誘發(fā)了γ-H2AX的磷酸化〔10〕，從而激活下游各種通路，包括p53、PKC、AKT、mTOR、AMPK等等〔11〕。ATM通路錯(cuò)綜復(fù)雜，下游通路存在大量的交叉通路，多種蛋白之間功能相互覆蓋，例如，目前已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ATM激活時(shí)，可對(duì)下游700多個(gè)蛋白產(chǎn)生不同的變化〔12〕。本研究表明由于I/R刺激，導(dǎo)致ATM通路啟動(dòng)，存在DNA修復(fù)機(jī)制。ATM通路啟動(dòng)有助于損傷組織和細(xì)胞的遺傳物質(zhì)修復(fù)。

PKC-Nrf2/Keap1-ARE抗氧化通路是機(jī)體內(nèi)最重要的清除自由基的通路之一，在抵抗病理?xiàng)l件下產(chǎn)生的過(guò)量氧自由基、維持體內(nèi)氧化還原平衡起重要的作用〔13，14〕。缺血釋放的大量刺激物質(zhì)經(jīng)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使存在于胞質(zhì)中無(wú)活性的PKC向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移而被活化，磷酸化下并激活游蛋白，譬如對(duì)Nrf2起磷酸化作用；Nrf2作為一種轉(zhuǎn)錄因子，在氧化還原平衡狀態(tài)下，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，與Keap1結(jié)合處于非活性狀態(tài)，當(dāng)胞內(nèi)出現(xiàn)過(guò)量自由基時(shí)，PKC磷酸化Nrf2使其從Keap1上解離下來(lái)，轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核，同核內(nèi)ARE結(jié)合，啟動(dòng)ARE識(shí)別調(diào)控抗氧化酶或抗炎蛋白基因的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抵御能力，SOD即是Nrf2/ARE啟動(dòng)的下游基因之一。目前有少數(shù)研究證實(shí)了ATM和PKC的相關(guān)性，如Li等〔15〕發(fā)現(xiàn)在成骨細(xì)胞中，敲減ATM基因后，PKC表達(dá)相應(yīng)減少，Matsuda等〔16〕發(fā)現(xiàn)ATM抑制劑減少了乙肝病毒上調(diào)的PKC蛋白表達(dá)。本研究揭示ATM參與了抗氧化應(yīng)激的壓力過(guò)程。

Sev作為鹵族麻醉藥之一，已證實(shí)其對(duì)大鼠肺I/R模型有保護(hù)作用，其涉及的機(jī)制包括抗氧化應(yīng)激反應(yīng)〔3，17〕，降低炎癥反應(yīng)〔17，18〕及抑制肺組織細(xì)胞凋亡作用〔19〕，但其保護(hù)作用機(jī)制仍需深入研究。本研究發(fā)現(xiàn)Sev的LIRI保護(hù)作用中存在ATM、PKC、Nrf2、SOD的序貫激活關(guān)系，ATM參與調(diào)控Sev的抗氧化應(yīng)激作用，從而對(duì)于肺水腫等肺部損傷有緩解作用。