穴位貼敷對(duì)衰老大鼠Caspase-3和Caspase-8因子表達(dá)的影響

孫曉婷 李 魏 于 睿 張 歡 毛智慧 劉曉亭

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847)

肌肉衰減綜合征由美國學(xué)者Rosenberg〔1〕于1997年首先提出，用以描述骨骼肌老化的進(jìn)程，其質(zhì)量及力量均呈顯著下降趨勢(shì)。2010年，老年肌肉衰減綜合征歐洲工作組(EWGSOP)的報(bào)告〔2〕，將肌肉衰減綜合征定義為，以老年人骨骼肌質(zhì)量和骨骼肌力量及功能的降低為主要特征的退行性病征，主要強(qiáng)調(diào)肌肉質(zhì)量和肌肉功能的下降。肌肉衰減綜合征的發(fā)生與衰老過程中線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的密切聯(lián)系應(yīng)值得關(guān)注，而作為細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心，線粒體可通過Caspase依賴性信號(hào)通路Caspase非依賴性信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔3〕。本實(shí)驗(yàn)探討穴位貼敷療法對(duì)肌肉衰減綜合征大鼠Caspase-3和Caspase-8的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 雄性大鼠20只，清潔級(jí)，體重210～240 g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK-(遼)2015-0001。購入后于本學(xué)校實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房IVC獨(dú)立送風(fēng)飼養(yǎng)系統(tǒng)中在SPF條件下分籠飼養(yǎng)，以國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類飼料喂養(yǎng)，自由飲食、飲水，溫度范圍21℃±2℃，相對(duì)濕度55%±5%。

1.2藥品、主要試劑及儀器 穴位貼敷的藥物由黃芪、黨參、茯苓、甘草、白芥子、細(xì)辛、姜汁等組成(沈陽遼河大藥房提供)，敷料為醫(yī)用無紡布膠帶(南昌市富達(dá)醫(yī)療器械有限公司)。D-半乳糖(美國Genview公司，批號(hào)5BN11010220)、氯化鈉注射液(遼寧民康制藥有限公司，批號(hào)H20054022)。Caspase-3試劑盒及Caspase-8試劑盒(天津市灝洋生物制品科技有限公司)。酶標(biāo)儀〔賽默飛爾(上海)儀器有限公司〕，恒溫水浴箱(河北黃驊航天儀器廠)。

1.3方法

1.3.1膏藥制作方法與給藥 于穴位貼敷當(dāng)天，將黃芪、黨參、茯苓、甘草、白芥子、細(xì)辛等藥物按比例研成粉末，過200目篩，加適量姜汁調(diào)勻至糊狀，制備成0.5 cm×0.5 cm大小的藥塊，用3 cm×3 cm大小的醫(yī)用無紡布膠帶固定于穴位貼敷組大鼠的雙側(cè)脾俞、雙側(cè)足三里穴位，再用一次性透氣孔膠帶纏繞一圈加以固定，對(duì)照組直接貼無紡布膠帶于雙側(cè)脾俞、雙側(cè)足三里，每次貼敷6 h，持續(xù)4 w。

1.3.2動(dòng)物分組與模型制備 將20只SD大鼠隨機(jī)分為衰老模型組和穴位貼敷組(貼敷組)。參照文獻(xiàn)〔4〕的方法，每個(gè)大鼠按125 mg·kg-1·d-1的劑量，進(jìn)行D-半乳糖腹腔注射，共6 w。

1.3.3動(dòng)物取材及指標(biāo)檢測(cè) 末次貼敷24 h后麻醉，取雙側(cè)股直肌，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)量組織中Caspase-3和Caspase-8含量，測(cè)量過程嚴(yán)格按照試劑說明進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

貼敷組與衰老模型組Caspase-3和Caspase-8的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組Caspase-3和Caspase-8的比較

3 討 論

肌肉衰減綜合征是隨著年齡的增加出現(xiàn)的肌肉數(shù)量的減少及肌力的降低，主要表現(xiàn)為肌肉組織的萎縮、肌纖維束變窄、骨骼肌橫截面積減小、肌肉力量減退、肌肉代謝能力下降和脂肪組織增多等特征。骨骼肌力量的衰退，可使老年人的活動(dòng)能力和平衡能力減弱，易發(fā)生跌倒，甚至導(dǎo)致老年人長期臥床。對(duì)于個(gè)人家庭來講，增加了老人自身的痛苦，也增加了其家人的經(jīng)濟(jì)及精力的負(fù)擔(dān)。對(duì)于社會(huì)來講，增加了社會(huì)的醫(yī)療保健成本。因此，有效干預(yù)老年人的肌肉衰減綜合征的發(fā)生顯得尤為重要。肌肉衰減綜合征的病因病機(jī)復(fù)雜多樣，包括活動(dòng)量不足、營養(yǎng)缺乏、肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)量減少和功能減退、蛋白質(zhì)營養(yǎng)素的缺乏、骨骼肌線粒體功能紊亂、激素水平變化、基因與種族等因素相關(guān)，目前尚無較完備的理論。但有研究證實(shí)，衰老過程中線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路在肌肉衰減綜合征的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用〔5〕。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脾主運(yùn)化、主統(tǒng)血、主四肢肌肉，是“氣血生化之源”、“后天之本”。如果脾胃失健，便不能運(yùn)化水谷精微至全身，就會(huì)出現(xiàn)肌肉萎縮、疲勞、肌耐力下降。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度來講，脾的功能與線粒體的功能在某種程度上是相似的，脾主肌肉亦是通過線粒體的功能來實(shí)現(xiàn)的〔6〕。線粒體是細(xì)胞中制造能量的結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞進(jìn)行能量代謝的重要場(chǎng)所，具有“細(xì)胞的發(fā)電廠”之稱。線粒體通過氧化磷酸化和三羧酸循環(huán)、氧化體內(nèi)三大營養(yǎng)物質(zhì)(糖、蛋白質(zhì)、脂肪)生成腺苷三磷酸(ATP)，從而為細(xì)胞各項(xiàng)生命活動(dòng)供應(yīng)能量，也為肌肉收縮提供能量。這與中醫(yī)中，脾能運(yùn)化水谷精微、生化氣血、潤養(yǎng)肌肉的功能相一致。另一方面，線粒體迅速吸收Ca2+的能力使其成為細(xì)胞中Ca2+的緩沖區(qū)，線粒體可以儲(chǔ)存Ca2+，控制細(xì)胞中Ca2+濃度的動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)而維持細(xì)胞的功能及肌肉的正常功能狀態(tài)。線粒體這一功能也與中醫(yī)學(xué)的“脾主肌肉”極其相似。有研究發(fā)現(xiàn)，長期脾虛模型大鼠的心肌、肝、胃黏膜和骨骼肌細(xì)胞線粒體含量減少，體積縮小或腫脹，線粒體結(jié)構(gòu)遭到破壞，基質(zhì)改變，而四君子湯復(fù)健組，其線粒體含量增加，結(jié)構(gòu)恢復(fù)也接近正?！?〕，其實(shí)驗(yàn)通過中醫(yī)健脾的方法，達(dá)到了改善線粒體的效果，從實(shí)踐上證實(shí)了脾與線粒體的相關(guān)性。

線粒體不僅是“細(xì)胞的發(fā)電廠”，而且在細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程中起著重要的作用。根據(jù)目前的研究來看，線粒體參與細(xì)胞凋亡的途徑大致有三條，第一條途徑為線粒體通透性的改變，當(dāng)線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔(MPTP)過度開放時(shí)，可以導(dǎo)致跨膜電位消失，線粒體呼吸鏈斷裂，而且還會(huì)釋放出天冬氨酸特異性的Caspase家族激活因子〔8〕，從而激活Caspase，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡過程。Gao等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，MPTP持續(xù)開放時(shí)，出現(xiàn)了膜電位的降低，Caspase-3、-8、-9的活化，并且細(xì)胞凋亡增加。第二條途徑為線粒體膜電位(MMP)的改變，當(dāng)MMP下降時(shí)，可導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡，而MMP的降低與MPTP的持續(xù)開放有關(guān)〔10〕，同時(shí)又可以進(jìn)一步導(dǎo)致MPTP的過度開放。第三條途徑線粒體膜磷脂的改變，心磷脂(CL)通過調(diào)節(jié)前凋亡因子從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而開啟線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Kagan等〔11〕的研究證實(shí)，在凋亡的過程中，CL的成分增加到了總量的40%。

在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中，線粒體通透性的改變介導(dǎo)的Caspase依賴性細(xì)胞凋亡信號(hào)通路在肌肉衰減綜合征的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，而在對(duì)Caspase依賴性的凋亡過程中，Caspase-3和Caspase-8又起著比較關(guān)鍵的作用。一方面，在該通路中細(xì)胞色素C(cytC)與凋亡蛋白酶活化因子(Apaf)-1和Caspase前體蛋白(procaspase)-9可形成凋亡小體。當(dāng)MPTP過度開放時(shí)，可導(dǎo)致cytC的釋放，在脫氧腺苷三磷酸(dATP)存在的情況下，與Apaf-1和Procaspase-9相結(jié)合，形成凋亡小體，從而激活細(xì)胞凋亡啟動(dòng)因子Caspase-9，隨后又激活細(xì)胞凋亡執(zhí)行因子Caspase-3，繼而使細(xì)胞走向不可逆的凋亡〔12，13〕。李海鵬等〔14〕研究顯示，快速老化小鼠腓腸肌中Apaf-1和Caspase-3的表達(dá)均顯著上調(diào)，這說明衰老促進(jìn)了凋亡信號(hào)在骨骼肌中的表達(dá)，從而導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞凋亡及肌肉衰減綜合征的發(fā)生。另一方面Caspase-8在Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中處于核心地位，幾乎能激活所有凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的Caspase而誘發(fā)凋亡〔15〕。Caspase-8主要定位于線粒體，其可以自我活化，同時(shí)也可以在顆粒酶B的剪切下活化，而Caspase-8的激活不但可以啟動(dòng)細(xì)胞凋亡外途徑，還可以啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)途徑來導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase-8活化后能引發(fā)Caspase蛋白酶的解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，然后進(jìn)一步激活下游的Caspase-6、Caspase-7 等同源酶，最后激活其效應(yīng)物Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔16〕，使肌肉萎縮，肌力下降。同時(shí)，激活的Caspase-8能夠裂解Bcl-2家族成員Bid，裂解產(chǎn)物的羧基端片段tBid轉(zhuǎn)移到線粒體上，誘導(dǎo)線粒體cytC的釋放〔17〕，最終激活細(xì)胞凋亡執(zhí)行因子Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，可以通過抑制Caspase-3和Caspase-8的表達(dá)來阻斷骨骼肌細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到減緩肌肉衰減綜合征的發(fā)生及發(fā)展的效果。同時(shí)，肌肉衰減綜合征在中醫(yī)學(xué)上屬“痿證”范疇，其病因病機(jī)多為脾胃虧虛。那么從補(bǔ)益脾胃入手，觀察中藥貼敷后Caspase-3和Caspase-8的表達(dá)，以此來探討穴位貼敷對(duì)肌肉衰減綜合征的緩解是否有意義。