濱蒿內(nèi)酯基于CAR調(diào)控CYP3A4轉(zhuǎn)錄表達(dá)的作用機(jī)制

畢紅東 馬安寧 劉 杰 郭娜娜 龐澤華 李寶群

(承德醫(yī)學(xué)院藥理教研室，河北 承德 067020)

CYP3A4為 CYP450超家族的成員，參與了50%以上臨床常用藥和膽紅素的代謝〔1〕。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)核受體是調(diào)控CYP3A表達(dá)的關(guān)鍵因子；有研究證實(shí)結(jié)構(gòu)性雄甾烷受體(CAR)可誘導(dǎo)CYP3A4的轉(zhuǎn)錄〔2〕，一些具有解毒保肝的中草藥(TCMs)都可影響藥物代謝酶表達(dá)〔3〕，但尚缺乏分子機(jī)制的研究。茵桅黃具有清熱解毒、利膽保肝等作用，臨床用于治療肝炎、黃疸等疾病〔4〕，濱蒿內(nèi)酯是傳統(tǒng)中藥茵陳/茵陳蒿中的有效單體，而茵陳則為茵梔黃方劑的主要成分，研究發(fā)現(xiàn)〔5〕茵梔黃可通過(guò)核受體CAR誘導(dǎo)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)2，繼而證實(shí)其活性成分之一即為濱蒿內(nèi)酯，本研究進(jìn)一步闡明濱蒿內(nèi)酯對(duì)CYP3A4表達(dá)的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人張氏(Chang Liver)細(xì)胞由本室自行凍存；rTaq酶購(gòu)自TaKaRa公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒/報(bào)告基因分析試劑盒購(gòu)自Promega公司；編碼CAR及CYP3A4報(bào)告基因載體由中南大學(xué)臨床實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。濱蒿內(nèi)酯二甲基亞砜(DMSO)溶解購(gòu)自湖南省藥檢所。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理 37℃、5% CO2用DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)Chang Liver細(xì)胞，DMSO為溶媒對(duì)照，加入0.01、0.10和1.00 μmol/L濱蒿內(nèi)酯孵育24、36、48 h后收集細(xì)胞，制備總RNA后合成第1鏈cDNA。正向引物ccccctgaaaatttgggccaaaga，反向引物taattttggggctcaaaggct；擴(kuò)增條件94℃ 2 min；94℃ 30 s；42℃ 30 s；72℃ 30 s,30個(gè)循環(huán),瓊脂糖凝膠電泳后以掃描灰度分析目的條帶信號(hào)強(qiáng)度。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h，按5×104細(xì)胞孔接種至96孔培養(yǎng)板，每組6孔，200 ng CYP3A4-promoter-Luc，50 ng hCARΔATG-pcDNA3.1B(-)，20 ng pRL-TK為內(nèi)對(duì)照與0.5 μl陽(yáng)離子脂質(zhì)體混合孵育后4 h后更換為普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)20 h后再次行藥物處理。

1.2.3報(bào)告基因檢測(cè) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h棄去原培養(yǎng)基，加入0.01、0.10和1.00 μmol/L濱蒿內(nèi)酯處理48 h后裂解細(xì)胞，同設(shè)DMSO溶媒對(duì)照組和含有10 μmol/L苯巴比妥-DMSO的陽(yáng)性對(duì)照組，各組細(xì)胞處理用報(bào)告基因分析試劑盒測(cè)定熒光素酶活性值共重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行ANOVA分析和LSD方法。

2 結(jié) 果

2.1濱蒿內(nèi)酯可影響CYP3A4轉(zhuǎn)錄表達(dá) 0.10和1.00 μmol/L濱蒿內(nèi)酯處理細(xì)胞24 h和36 h后CYP3A4 表達(dá)增強(qiáng)(圖1)，與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而濱蒿內(nèi)酯處理48 h后各濃度組都表現(xiàn)出抑制效應(yīng)，CYP3A4 表達(dá)量降低且各濃度組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

圖1 Chang Liver細(xì)胞中濱蒿內(nèi)酯對(duì)CYP3A4 mRNA電泳結(jié)果

將包含CYP3A4啟動(dòng)子的螢火蟲熒光素酶報(bào)告載體與hCAR真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染Chang Liver細(xì)胞，并加入編碼海腎熒光素酶的pRL-TK載體作為內(nèi)對(duì)照，苯巴比妥和各濃度濱蒿內(nèi)酯孵育處理均可誘導(dǎo)CAR所驅(qū)動(dòng)的CYP3A4的熒光素酶表達(dá)，與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見表2。

2.2濱蒿內(nèi)酯對(duì)CYP3A4的誘導(dǎo)機(jī)制 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后36 h，各濃度組細(xì)胞熒光素酶活性與對(duì)照組比較顯著增加，且CAR載體與空載體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，但不同濃度濱蒿內(nèi)酯組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表1 CYP3A4經(jīng)不同濱蒿內(nèi)酯濃度和不同時(shí)間處理后的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與0.01 μmol/L組比較：2)P<0.05

表2 不同濃度濱蒿內(nèi)酯處理36 h對(duì)CAR質(zhì)粒載體與CYP3A4表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄激活能力

與對(duì)照組比較：1)P<0.001；與空載體比較：2)P<0.001

3 討 論

臨床上出現(xiàn)黃疸主要是肝細(xì)胞對(duì)膽紅素?cái)z取與排泄障礙的結(jié)果，以往利膽退黃藥物的機(jī)制研究多集中在膽紅素轉(zhuǎn)運(yùn)體谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)A1上〔5〕，研究提示CYP450酶的活性顯著影響肝臟對(duì)膽紅素的攝取〔6〕。CYP3A4在人體中的表達(dá)存在30倍的差異〔1〕，CAR可介導(dǎo)苯巴比妥誘導(dǎo)多種CYP450酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，也是膽紅素代謝中的主要調(diào)節(jié)因子，在CAR基因敲除鼠中同樣可見膽汁淤積造成的肝臟損害〔7〕；目前臨床治療黃疸的藥物有苯巴比妥、熊去氧膽酸等〔8〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示濱蒿內(nèi)酯對(duì)CYP3A4表達(dá)的誘導(dǎo)呈現(xiàn)時(shí)間依賴性和劑量依賴性，與陽(yáng)性對(duì)照苯巴比妥的作用趨勢(shì)相似。然而作用48 h 后的抑制作用可能與濱蒿內(nèi)酯抗腫瘤抑制細(xì)胞增殖作用有關(guān)。本研究結(jié)果還提示CYP450酶活性低下可能是黃疸疾病發(fā)生和發(fā)展的重要原因，對(duì)CYP450酶的誘導(dǎo)可能是濱蒿內(nèi)酯等退黃藥物利膽退黃的作用基礎(chǔ)，因此，通過(guò)研究濱蒿內(nèi)酯對(duì)CYP酶的作用可為開發(fā)和研制治療黃疸的新藥及提高和改善臨床上現(xiàn)有治療黃疸藥物的療效提供理論依據(jù)。