桂枝茯苓丸對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠TNF-α和ET-1水平的影響

孫 勇 張 園 邢 影

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春 130033)

腦梗死(CI)是由于腦動(dòng)脈的急性閉塞導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧的急性神經(jīng)系統(tǒng)疾病。目前臨床上最為有效的治療手段為盡早恢復(fù)大腦血流，改善腦組織缺血、缺氧。然而，當(dāng)大腦血氧供應(yīng)恢復(fù)后，缺血再灌注(I/R)使得腦損傷進(jìn)一步加重。因此，盡早有效地改善閉塞血管血流，并降低I/R所致的進(jìn)一步損傷，阻止缺血性腦卒中的進(jìn)展亟待解決。桂枝茯苓丸最初應(yīng)用于婦科疾病，但近幾年一些研究發(fā)現(xiàn)，桂枝茯苓丸在治療CI方面具有重要作用〔1，2〕，本研究在制備腦I/R大鼠模型基礎(chǔ)上，檢測(cè)大鼠血清及腦組織中腫瘤壞死因子(TNF)-α、內(nèi)皮素(ET)-1含量變化，并通過超聲觀察頸動(dòng)脈的血流情況，為桂枝茯苓丸的腦保護(hù)提供實(shí)驗(yàn)及理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 選用健康清潔型大鼠90只(遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，許可證號(hào)：SCKK(遼)2015-0001)；桂枝茯苓丸(吉林天強(qiáng)制藥)；試劑：TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒和ET-1放射免疫試劑盒(上海酶聯(lián)生物)； 儀器：彩色多普勒超聲儀(型號(hào)LOGIQ7型，美國GE公司)。

1.2I/R大鼠模型的制備 250～300 g雄性Wistar大鼠，術(shù)前1 d禁食水，次日清晨10%水合氯醛腹腔注射(0.4 ml/100 g)，應(yīng)用線栓法(直徑0.2～0.3 mm，于1.8～2.0 cm處標(biāo)記)。正中切口，分離頸前區(qū)腺體及結(jié)締組織，暴露并分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、左側(cè)頸外動(dòng)脈及其分支、左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，暫時(shí)阻斷頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈血流，離斷頸外動(dòng)脈分支及頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，顯微剪在頸外動(dòng)脈近心端剪一小口，將線栓由頸外動(dòng)脈-頸動(dòng)脈分叉-頸內(nèi)動(dòng)脈方向進(jìn)入，達(dá)1.8～2.0 cm處停止進(jìn)入，固定線栓尾部，清理手術(shù)創(chuàng)口、消毒、縫合，從線栓置入1.8 cm處計(jì)時(shí)1 h后拔出線栓。假手術(shù)組只切開頸部皮膚，暴露血管結(jié)扎頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，除不插線栓外，其他步驟同上。術(shù)后24 h室內(nèi)溫度維持在25～28℃之間 ，大鼠體溫維持在35～37℃之間。

1.3動(dòng)物模型評(píng)價(jià) 參考Longa等〔3〕進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分：0分：無明顯神經(jīng)病學(xué)癥狀；1分：不能完全伸展左側(cè)前爪；2分：行走時(shí)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分：行走時(shí)向左側(cè)傾倒；4分：不能自行行走，意識(shí)水平下降。排除標(biāo)準(zhǔn):①無明顯神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)或癥狀很輕的大鼠;②手術(shù)造成蛛網(wǎng)膜下腔出血的大鼠;③手術(shù)時(shí)出血較多,癥狀很重，意識(shí)狀態(tài)不好甚至死亡的大鼠。剔除的大鼠隨機(jī)填補(bǔ)。

1.4動(dòng)物分組 將大鼠分為3組：假手術(shù)(對(duì)照)組30只、缺血組30只、治療組30只，每組中各分出15只單獨(dú)喂養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)第1天進(jìn)行頸動(dòng)脈超聲檢測(cè)，記錄雙側(cè)頸動(dòng)脈最高血流速度。

1.5灌胃方法 治療組1 ml濃縮藥液/次(桂枝茯苓丸溫開水稀釋，0.85 g稀釋為1 ml)〔4〕早晚各灌胃1次，對(duì)照組和缺血組灌等量生理鹽水，連續(xù)2 w。

1.6血清制備 各組灌胃2 w后，余15只大鼠于第15天分別用 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟，采用心臟穿刺取血，收集血液標(biāo)本，置于離心管中，輕輕顛倒混勻，放入高速離心機(jī)3 000 r/min，離心15 min，收集上層液作為待測(cè)血清，放置4℃冰箱保存。

1.7腦組織勻漿 留取血清同時(shí)分別留取大鼠腦組織，具體方法為用鑷子由枕骨大孔處向兩側(cè)撥開顱骨，取出患側(cè)腦組織(左腦)離心管稱重，計(jì)算出腦濕重，液氮保存；標(biāo)本置勻漿器內(nèi)加生理鹽水(按照W/V為1∶2)，冰水中研磨勻漿約10 min，移至1.5 ml EP管中，4℃條件12 000 r/min，15 min離心取上清，-20℃保存。

1.8檢測(cè)指標(biāo) 采用試劑盒方法(酶聯(lián)免疫和放免法)檢測(cè)各組血清和腦勻漿TNF-α、ET-1含量。第15日再次檢測(cè)雙側(cè)頸動(dòng)脈超聲，記錄最高血流速度，波幅的高低代表頸動(dòng)脈收縮期最大血流速度，頻率的多少代表大鼠的心率。

1.9數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)及方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組頸動(dòng)脈血流速度的比較 經(jīng)過15 d治療，治療組頸動(dòng)脈血流速度較治療前明顯增加(P<0.05)，與對(duì)照組和缺血組相比，治療組頸動(dòng)脈血流速度明顯增加(P<0.05)，對(duì)照組和缺血組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1，表1。

2.2治療后各組血清及腦組織中TNF-α及ET-1含量 缺血組血清、腦組織勻漿中TNF-α水平較對(duì)照組明顯增高(P<0.05)；較治療組明顯增高(P<0.05)。缺血組腦組織勻漿、血清中ET-1水平較對(duì)照組明顯增高(P<0.05)，較治療組明顯增高(P<0.05)。見表2。

治療前

治療后

組別治療前治療后對(duì)照組37.20± 2.8537.67±4.081)缺血組44.00±4.9341.93±3.411)治療組52.20±5.6169.53±19.442)

與治療組比較：1)P<0.05；與治療前比較：2)P<0.05

表2 治療后各組血清及腦組織中TNF-α水平比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與缺血組比較：2)P<0.05

3 討 論

桂枝茯薈丸出自于《金匱要略》〔5〕，是作為消除婦科腫塊的方劑記錄下來的，在婦科疾病的治療中取得了顯著療效〔6〕。隨著研究人員對(duì)其化學(xué)成分及藥理作用的深入研究及臨床、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的開展，不斷拓展了其應(yīng)用，目前在治療內(nèi)科〔7，8〕、外科〔9，10〕、皮膚〔11〕等各科疾病也起到了重要作用〔12〕。

CI發(fā)生后，由于腦組織缺血缺氧，不僅會(huì)產(chǎn)生大量抗原刺激免疫系統(tǒng)，而且有大量的炎性細(xì)胞浸潤和激活，引起免疫應(yīng)答過程，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等被激活，從而產(chǎn)生大量TNF-α、白細(xì)胞介素等細(xì)胞介質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)參與CI病理變化過程〔13〕。腦I/R時(shí)，管腔狹窄，激活的中性粒細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量ET〔14〕，同時(shí)升高的 ET 又作用于病灶區(qū)，引起腦血管強(qiáng)烈收縮，而致病變區(qū)繼發(fā)缺血性損害，加重神經(jīng)功能損害〔15〕。 目前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究〔16，17〕表明，CI急性期的血漿TNF-α、ET水平與梗死灶大小、腦水腫程度及臨床癥狀的嚴(yán)重程度一致。在正常生理情況下，ET和NO處于動(dòng)態(tài)平衡，以維持體內(nèi)血管的正常舒縮功能，在急性腦缺血或腦I/R超早期，NO可發(fā)揮重要的腦保護(hù)作用。但是在腦缺血及腦I/R后期，由于NO的神經(jīng)毒性作用替代了其保護(hù)作用，NO/ET平衡紊亂，NO和ET含量同時(shí)升高進(jìn)一步造成腦組織損傷。另外TNF-α的上調(diào)可以通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的黏附、血小板性血栓的形成，進(jìn)而促進(jìn)梗死期腦組織缺血壞死〔18〕。腦缺血期及I/R后期，降低血漿TNF-ɑ水平，抑制NO合酶(NOS)活性，進(jìn)一步減少ET含量或抑制其受體，是減輕缺血性及再灌注性腦損傷的重要途徑〔19〕。

桂枝茯苓丸是活血利水方，組成成分包括芍藥、桂枝、桃仁、茯苓、牡丹，方中桂枝溫經(jīng)通絡(luò)，配合茯苓達(dá)到健脾利水消痰作用，丹皮、芍藥、桃仁活血散淤消癥，共奏活血消痰利水之功，這與CI痰淤互結(jié)病理特征一致〔20〕?，F(xiàn)代藥理研究表明桂枝茯苓方具有抗炎〔21〕、免疫調(diào)節(jié)〔21〕、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞〔22〕、抗氧化〔23〕、改善循環(huán)〔20〕等作用?，F(xiàn)代動(dòng)物研究表明桂枝茯苓丸可通過抑制興奮性氨基酸、抑制缺血及再灌注后鈣離子大量內(nèi)流、拮抗TNF-α 參與的炎癥反應(yīng)、拮抗NO介導(dǎo)的ET-1所致的神經(jīng)損傷等作用機(jī)制，從而治療CI〔24～26〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)桂枝茯苓丸可降低I/R腦損傷大鼠TNF-α和ET-1水平，抑制炎癥反應(yīng)，減少血管內(nèi)皮細(xì)胞合成釋放 ET-1，改善腦循環(huán)，保護(hù)腦組織細(xì)胞。