中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)研究最新進(jìn)展

崔 蕊,方 玲,謝 風(fēng)

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春130033)

中性粒細(xì)胞是機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)中的一條非常重要的防線，它參與機(jī)體的免疫反應(yīng)主要是在病原體感染時(shí)，通過(guò)吞噬、脫顆粒來(lái)抵抗侵襲，形成吞噬體后，在內(nèi)部通過(guò)NADPH[1]形成具有高濃度的活性氧(reactive ox-ygen species,ROS)和抗菌蛋白可以用來(lái)殺滅病原微生物，而在2004年，Brinkmann等[2]首次研究證明，當(dāng)受到病原體刺激后，中性粒細(xì)胞可以將顆粒蛋白和去致密化染色質(zhì)排除細(xì)胞外，從而捕獲并殺死病原微生物，并將這一免疫過(guò)程稱(chēng)為中性粒細(xì)胞胞外誘捕。在2007年，Steinberg和Grinstein[3]將中性粒細(xì)胞這種被發(fā)現(xiàn)介于壞死和凋亡的死亡方式稱(chēng)為：NETosis(Neutrophil Extracellular Traps)。NETosis被認(rèn)為是一種中性粒細(xì)胞免疫應(yīng)答的新方式[4]。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，NETs不僅被認(rèn)為是一種全新的免疫方式，當(dāng)NETs的形成與清除不能達(dá)平衡，或結(jié)構(gòu)異常時(shí)，則參與多種自身免疫病[5]，同時(shí)，經(jīng)試驗(yàn)證明NETs與血栓形成、動(dòng)脈粥樣硬化，甚至腫瘤轉(zhuǎn)移都有密切關(guān)系。

1 NETs的形成及構(gòu)成

從形態(tài)學(xué)的角度 ，NETosis的主要特點(diǎn)是①顆粒的獲得②核結(jié)構(gòu)的改變。它是一個(gè)完全不同于壞死和凋亡的程序性死亡的過(guò)程。在NETs的形成過(guò)程中有一些酶也起到很重要的作用，如NADPH過(guò)氧化物酶、細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶 C和活性氧[6]等。但是，目前也有觀點(diǎn)認(rèn)為：研究證明[7]：NETosis產(chǎn)生過(guò)程有兩種不同的機(jī)制：因?yàn)榇碳ざ晕覛⑺佬再|(zhì)的NETosis以及因?yàn)榛钚约?xì)胞產(chǎn)生的NETosis。NETs是有解聚的DNA以及細(xì)胞蛋白構(gòu)成，主要由24種分別來(lái)自細(xì)胞顆粒、胞漿、胞核，組蛋白質(zhì)量比約占70%。電鏡下可見(jiàn)，纖維網(wǎng)的基本骨架是直徑約為17 nm的染色質(zhì)(組蛋白與DNA)，鑲嵌著直徑約為50 nm顆粒蛋白等顆粒狀物質(zhì)[8]，NETs成型以后可以以線性、網(wǎng)狀、膜狀等各種形態(tài)圍繞在中性粒細(xì)胞的周?chē)?，或者以片狀、棉絮等形狀游離在血液、肺泡腔等，可見(jiàn)其形態(tài)可以受空間血流等影響[9]，研究證明[10-12]，巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞也可產(chǎn)生網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)發(fā)揮一定的免疫作用。

2 NETs的免疫原性

宿主來(lái)源或者某些外源的物質(zhì)如細(xì)菌、真菌等均可以刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs[13]，比如：12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇可以在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生NETs，因此，它是體外實(shí)驗(yàn)常用到的NETs體外引物。血清淀粉樣蛋白A也可以誘導(dǎo)NETs形成[14]，一些炎性介質(zhì)也可以誘導(dǎo)NETs的生成[15]。在引物誘導(dǎo)下，蛋白激酶C在活化后可以通過(guò)絲氨酸 /蘇氨酸蛋白激酶 /絲裂素活化蛋白激酶激酶 /細(xì)胞外的信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)通路磷酸化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，生成 NETs 形成所需ROS。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶等經(jīng)一系列酶促反應(yīng)生成超氧化氧離子、過(guò)氧化氫(H2O2) 、次 氯酸( HOCl)等。HOCl是刺激 NETs 釋放的關(guān)鍵ROS成分[16]。ROS和自噬影響下的染色體解聚是NETs形成的特征之一。NE、精氨酸脫亞胺酶 4( peptidylarginine deiminase type 4 PAD4 )和髓過(guò)氧化物酶( myeloperoxidase，MPO )共同參與這一過(guò)程，尤其PAD4可催化 3 /4 的精氨酸殘基瓜氨酸化，從而減弱靜電吸引，造成組蛋白結(jié)合DNA的能力下降[17]。而NET的抗菌策略主要可以分為①將表面帶有正電荷的病原體捕獲，限制其擴(kuò)散[18]。②NETs內(nèi)含有抗菌酶及組蛋白可以殺傷病原體。③NETs內(nèi)部含有的NE可分解沙門(mén)菌等細(xì)菌的毒力因子。

3 NETs與臨床疾病

3.1NETs與感染

當(dāng)機(jī)體受到病原微生物侵害時(shí)，因?yàn)榫奘杉?xì)胞等分泌的炎性因子，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞大量聚集在感染部位，分泌形成NETs結(jié)構(gòu)中富含的組蛋白、蛋白肽和抗菌肽等，其殺傷力強(qiáng)于中性粒細(xì)胞吞噬引起的殺菌效率，NETs可以對(duì)多種病原微生物都有殺滅和清除的作用，但是人體血液中存在可以降解NETs的脫氧核糖核酸酶1(Dnase1),當(dāng)此酶缺乏時(shí)，大量NETs會(huì)聚集，NETs中的多種蛋白酶和抗菌肽可以導(dǎo)致內(nèi)皮及上皮細(xì)胞的損傷，而組蛋白是造成損傷的主要原因，因?yàn)榻M蛋白不僅有抗菌作用，也有很強(qiáng)的毒性。NETs也會(huì)與炎性介質(zhì)呈協(xié)同作用，并與血小板之間正反饋激活參與急性肺損傷的發(fā)病。慢性阻塞性肺疾病是一種非常典型的慢性炎癥反應(yīng)性疾病，患者的痰液中存在胞外DNA，其結(jié)構(gòu)與NETs-DNA相似[19]，證明NETosis參與COPD的過(guò)程，Ting Liu[20]等同樣證明了上面的觀點(diǎn)。

3.2NETs與自身免疫病

①小血管炎(ANCA-associated vasculitides,AAV)是一種自身免疫疾病，主要累及全身多個(gè)系統(tǒng)，ANCA主要作用于髓過(guò)氧化物酶(MPO)和中性粒細(xì)胞表面靶抗原蛋白酶3(PR3)是導(dǎo)致韋格納肉芽腫及多脈管炎發(fā)生的一個(gè)原因，而Kessenbrock等[21]則證實(shí)了TNF-a(腫瘤壞死因子a)可以被ANCN活化刺激產(chǎn)生NETs，NETs存在特異靶抗原PR3、MPO并呈遞給樹(shù)突狀細(xì)胞，這是一個(gè)惡性循環(huán)。②系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者的中性粒細(xì)胞極易形成NETs，部分患者因?yàn)榻到釴ETs的能力不良，機(jī)體組織會(huì)因?yàn)镹ETs成分持續(xù)暴露產(chǎn)生損傷，同時(shí)再次作為抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)。NETs、IFN-a與炎性小體相互發(fā)生作用，可以形成病理性的反饋環(huán)路，SLE患者中性粒細(xì)胞可以產(chǎn)生變異，稱(chēng)為L(zhǎng)DGs可以促進(jìn)大量炎性介質(zhì)的釋放，大量損傷內(nèi)皮細(xì)胞。③類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以多關(guān)節(jié)對(duì)稱(chēng)受累的慢性炎癥性的自身免疫性疾病，主要累積小關(guān)節(jié)，陳本露等[22]選取88例類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者作為實(shí)驗(yàn)組，20例健康體檢者為對(duì)照組，檢測(cè)dsDNA/NETs證明RA患者血清中NETs換輛高于正常人，病人外周血中中性粒細(xì)胞PAD4mRNA表達(dá)顯著增高，且外周血中PBMCs中組蛋白瓜氨酸化顯著升高，不排除與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病有關(guān)，甚至與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

3.3NETs與其他相關(guān)疾病

最新研究表明NETs對(duì)血栓和凝血形成有促進(jìn)作用，NETs的ROS主要通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷來(lái)促進(jìn)血栓的形成[23]。同時(shí)又可與血小板相互作用促進(jìn)血栓的形成及提高血栓的穩(wěn)定性，并且NETs具有抵抗rt-PA對(duì)血栓誘導(dǎo)的溶解作用[24].在靜脈血栓中，NETs為靜脈血栓形成提供了一個(gè)骨架結(jié)構(gòu)很集中的細(xì)胞及刺激因素，它可以不受纖維蛋白途徑的影響[25]，同時(shí)，NETs可以刺激內(nèi)源性。動(dòng)脈血栓主要由動(dòng)脈粥樣硬化板塊的侵襲或者破裂引起，既往有研究[26]證明：在動(dòng)脈粥樣硬化的病變中存在NETs，同樣我們我們也可觀察到NETs[27]出現(xiàn)在急性心肌梗死、腦梗死患者的新鮮溶解的血栓標(biāo)本。有研究證明[28]主要機(jī)制是存在于自體DNA和中性粒細(xì)胞內(nèi)部的克里蛋白可以活化血管壁中血漿樹(shù)突，并且I型的干擾素會(huì)同時(shí)發(fā)生反應(yīng)。據(jù)報(bào)道[29,30]，腫瘤細(xì)胞增殖、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及血管生成也可能與NETs中的多種組分有關(guān)，這為我們治療腫瘤提供了一個(gè)新思路，有待進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)與展望

NETs在多種疾病發(fā)病、治療方面逐漸占有重要地位。一方面，NETs可以導(dǎo)致多種自身免疫病的發(fā)生，另一方面NETs也具有診斷、預(yù)測(cè)、靶向治療、預(yù)后等作用。比如cf-DNA/NETs可以作為監(jiān)測(cè)炎性過(guò)程的重要標(biāo)志物，血漿中cf-DNA/NETs濃度水平與急性心肌梗死嚴(yán)重程度相關(guān)，急性腦梗死動(dòng)脈血栓中會(huì)存在大量NETs的成分,NETs有可能為急性腦梗死溶栓治療提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)。再如，NETs的循環(huán)可以被DNase或者PAD4抑制劑阻斷，這將成為抗腫瘤的一個(gè)新的靶點(diǎn)。但同時(shí)，我們需要控制NETs產(chǎn)生與溶解的平衡，不可以在機(jī)體中產(chǎn)生過(guò)多的NETs。綜上，我們應(yīng)深入研究NETs，避免自身免疫病的發(fā)生及一些疾病新的靶點(diǎn)治療。

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