不同養(yǎng)殖地區(qū)日本醫(yī)蛭的生長及抗凝血活性研究

蒲德成 曹敏 余米

摘要 [目的]探究不同養(yǎng)殖地區(qū)日本醫(yī)蛭的生長和抗凝血活性。[方法]以野外捕獲（江蘇）的日本醫(yī)蛭為對照組，以重慶、廣西、廣東養(yǎng)殖的日本醫(yī)蛭為試驗組，進行人工養(yǎng)殖試驗。[結果]日本醫(yī)蛭能在不同地區(qū)進行人工馴養(yǎng);人工養(yǎng)殖的日本醫(yī)蛭最低存活率為（73.50±0.51）%，120日齡最低體重為（2.984 3±0.022 1） g，與野外捕獲的日本醫(yī)蛭體重存在顯著差異。日本醫(yī)蛭在出苗30 d內體重增長率最大，死亡率最高，均隨著養(yǎng)殖時間的延長而降低。人工養(yǎng)殖日本醫(yī)蛭的抗血凝活性為168 U/g，與野生日本醫(yī)蛭（275 U/g）存在顯著差異。[結論]日本醫(yī)蛭能在不同地方引種養(yǎng)殖，且其抗凝血活性能達到《中國藥典》規(guī)定標準。

關鍵詞 日本醫(yī)蛭;人工養(yǎng)殖;成活率;抗凝血活性

中圖分類號 S 917.4? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）23-0121-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.032

Study on the Growth and Anticoagulant Activity of Hirudo nipponia in Different Cultivation Areas

PU De-cheng1，CAO Min2，YU Mi2

（1.Agricultural and Rural Committee of Wuxi County， Chongqing 405899;2.Chongqing Institute of Medicinal Plant Cultivation， Chongqing 408435）

Abstract [Objective] To study the growth and anticoagulant activity of Hirudo nipponia in? different culture areas.[Method] H.nipponia captured in the field （Jiangsu）? was used as the control group， the artificial culture experiment was carried out in Chongqing， Guangxi and Guangdong.[Result] H.nipponia could be artificially raised in different regions.The lowest survival rate of H.nipponia? cultured artificially was （73.50±0.51）%，? the lowest body weight at 120-day-age was （2.984 3±0.022 1） g， there was significant difference? of? the body weight? between cultured and captured H.nipponia.The relative growth rate of body weight and mortality rate of H.nipponia were the highest within 30 days? after emergence， which decreased with prolonging of cultivation time. The anticoagulant activity of cultured H.nipponia was 168 U/g，which was significantly different from that of wild H.nipponia（275 U/g）.[Conclusion] H.nipponia could be introduced and cultured in different regions， and its anticoagulant activity could meet the standard stipulated in China Pharmacopoeia.

Key words Hirudo nipponia;Artificial culture;Survival rate;Anticoagulant activity

基金項目 重慶市科學技術局項目（cstc2018jxjl-jbky00003，cstc2019jscx-msxmX0357）;重慶市衛(wèi)健委“藥用動物學”重點學科建設項目;重慶市生態(tài)漁產業(yè)技術體系建設專項。

作者簡介 蒲德成（1980—），男，四川南充人，高級工程師，碩士，從事名優(yōu)水生動物保種開發(fā)及技術推廣工作。通信作者，助理研究員，碩士，從事藥用水生動物養(yǎng)殖開發(fā)利用研究。

收稿日期 2021-07-20

日本醫(yī)蛭（Hirudo nippnica）別名水蛭、稻田蛭，隸屬無吻蛭目（Arhynchobdellida）醫(yī)蛭科（Hirudinidae）醫(yī)蛭屬（Hirudo），模式產地為日本，國內主要分布在北方，在西南地區(qū)亦有分布[1]，是我國心腦血管疾病治療藥物的主要原料。由于心腦血管疾病治療藥物的研發(fā)，對日本醫(yī)蛭的需求逐年增加，加上環(huán)境的改變，原本豐富的日本醫(yī)蛭資源現(xiàn)已不能滿足國內的需求，開展人工養(yǎng)殖勢在必行。

國內有關日本醫(yī)蛭的研究主要集中在養(yǎng)殖和繁殖上[2-4]，有關日本醫(yī)蛭的生物學特性與腸道微生物等領域[5-7]研究亦有報道，而其抗凝血活性則一直是研究的熱點[8-10]。但是，有關不同地區(qū)養(yǎng)殖日本醫(yī)蛭的對比研究還未見報道。筆者在不同養(yǎng)殖地區(qū)開展養(yǎng)殖試驗，比較了野生與人工養(yǎng)殖日本醫(yī)蛭的體重、存活率以及不同地區(qū)的抗凝血活性差異，以期為日本醫(yī)蛭的人工養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

日本醫(yī)蛭野外樣本于2018年9月下旬收集于江蘇沛縣，共捕獲2 586條，隨機抓取258條，用濾紙吸掉日本醫(yī)蛭體表水分，進行體重測定;重慶、廣東、廣西組日本醫(yī)蛭均采用重慶南川基地人工繁殖培育的日本醫(yī)蛭幼苗。

1.2 飼喂方法

采用長125 cm、寬80 cm、高75 cm的聚氯乙烯（PVC）水產養(yǎng)殖箱進行養(yǎng)殖，箱體水深8 cm，養(yǎng)殖水溫控制在28～30 ℃，養(yǎng)殖密度為1 000條/m2，設3 個重復組;每天07：00—09：00換水，每7 d投喂豬血1次，投喂量為醫(yī)蛭體重的200%。

1.3 測定方法 每隔30 d隨機抽樣50條，測定日本醫(yī)蛭體重（投喂前1 d測量體重），分別計算增重率和存活率?？鼓钚缘臏y定采用凝血酶滴定法[11]。

存活率（%）的計算公式如下：

r=aN×100%（1）

式中，r為各時期的存活率（%），a為各個時期的存活數(shù)，N為試驗開始時總個數(shù)。

體重增長率（%）的計算公式如下：

ΔW=WT-WT-1WT-1×100%（2）

式中，ΔW為體重增長率（%），T表示日齡，WT表示T日齡測量的體重，WT-1表示（T-30）日齡測量的體重。

記錄消耗凝血酶溶液的體積，按照以下公式計算：

U=C1V1C2V2（3）

式中，U為每 1 g 供試品含凝血酶活性單位（U/g），C1為凝血酶溶液的質量濃度（U/mL），C2為供試品溶液的質量濃度（g/L），V1為消耗凝血酶溶液的體積（μL），V2為供試品溶液的加入量（μL）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，采用單因素方差分析進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 野外日本醫(yī)蛭體重分布 對野外采集日本醫(yī)蛭的體重分布進行分析，結果見圖1。從圖1可以看出，野生日本醫(yī)蛭體重集中分布在>0.10～0.20 g，占比62.3%;其次為>0.20～0.25 g和>0.05～0.10 g，占比分別為15.0%和11.9%;體重大于0.25 g的日本醫(yī)蛭僅占8.5%。

2.2 不同養(yǎng)殖地日本醫(yī)蛭體重與存活率

從表1可以看出，

1～120 d人工養(yǎng)殖日本醫(yī)蛭的體重逐漸增加，存活率逐漸降低。野生與人工養(yǎng)殖的日本醫(yī)蛭體重存在明顯差異，且人工養(yǎng)殖的日本醫(yī)蛭最低體重（重慶）是野生日本醫(yī)蛭的17.01倍。3個養(yǎng)殖場中，廣東養(yǎng)殖日本醫(yī)蛭的體重最大，達到（4.605 0±0.023 8）g。重慶、廣西、廣東地區(qū)日本醫(yī)蛭體重增長率的變化趨勢基本一致，均隨日齡的增加而下降;廣東、廣西、重慶地區(qū)30 d日本醫(yī)蛭的體重增長率分別為2 693%、2 389%和1 744%;30～120 d日本醫(yī)蛭的體重增長率明顯趨緩。各養(yǎng)殖場在30 d時日本醫(yī)蛭的死亡率均最大，分別為10.99%、20.80%和22.80%;30～120 d日本醫(yī)蛭的死亡率趨于平緩（圖2）。

2.3 不同養(yǎng)殖地區(qū)日本醫(yī)蛭抗凝血活性

從圖3可以看出，日本醫(yī)蛭的抗凝血活性均高于《中國藥典》規(guī)定標準，其中野生日本醫(yī)蛭（江蘇）的抗凝血活性最高（275 U/g），與其他養(yǎng)殖地區(qū)均存在顯著差異（P<0.05）;人工養(yǎng)殖的日本醫(yī)蛭中，重慶地區(qū)日本醫(yī)蛭的抗凝血活性最高（225 U/g），與廣西和廣東地區(qū)存在顯著差異（P<0.05），廣西、廣東地區(qū)養(yǎng)殖的日本醫(yī)蛭抗凝血活性分別為168和175 U/g。

3 討論

3.1 日本醫(yī)蛭養(yǎng)殖中影響成活率的因素分析

不同養(yǎng)殖

用水水質指標與水生動物的生長密切相關。水體pH過高或過低不僅影響水生動物幼苗的消化酶活性[12]、發(fā)育進程[13]，而且影響其存活率[14]。水體的硬度過高或過低會對水生生物的繁殖和幼苗存活產生不利影響[15-16]，也有研究表明高硬度

注：相同小寫字母表示差異不顯著（P>0.05）;不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）

Note： The same lowercase letters indicated no significant difference （P>0.05）; different lowercase letters indicated significant difference （P<0.05）

圖3 不同養(yǎng)殖地區(qū)日本醫(yī)蛭抗凝血活性

Fig.3 ?The anticoagulant activity of H.nipponia in different farming areas

水有利于七彩神仙魚幼魚的生長發(fā)育[17]。此外，一定濃度內的Ca2+、Mg2+能有效降低重金屬對浮游植物、動物的毒性[18-19]，從而達到保護水生生物的目的。水體中氨氮含量過高不僅會導致水生生物氨氮中毒，而且會使水生生物體將大部分的能量用于機體消耗，從而導致飼料轉化率下降[20]，甚至會降低水生生物幼苗的存活率[21]。因此，養(yǎng)殖水體的水質可能會影響日本醫(yī)蛭幼苗的存活率。該試驗發(fā)現(xiàn)日本醫(yī)蛭原生地水域和養(yǎng)殖地用水的氨氮含量及Ca2+、Mg2+濃度均較高，推測日本醫(yī)蛭喜高鈣鎂離子水體，且對水體中氨氮具有一定的耐受力。結合試驗地水質指標分析，廣西、廣東地區(qū)日本醫(yī)蛭幼苗存活率低與水體中氨氮含量過高有一定的關系。

3.2 日本醫(yī)蛭的抗凝血活性

目前抗凝血活性測試方式主要有生物活性測定法、免疫測定法和化學測定法[22]，其中生物活性測定法測試方式較多、操作簡單，但是受凝血酶純度的影響較大。影響藥用類水蛭抗凝血活性的因素很多，例如吸血類高于非吸血類[23-24]，水蛭頭部明顯高于其他部位[25-26]，鮮品水蛭的抗凝血活性明顯高于干品。野生水蛭抗凝血活性較高的主要原因可能是其體重較輕，相較于人工養(yǎng)殖的日本醫(yī)蛭，其一直處于“饑餓”狀態(tài)，水蛭素分泌較多，其活性處于較高水平。

綜上所述，人工養(yǎng)殖日本醫(yī)蛭可作為藥用材料來源，在幼苗期間應特別注意加強養(yǎng)殖水質管理來提高幼苗存活率。

參考文獻

[1]楊潼.中國動物志：環(huán)節(jié)動物門 蛭綱 [M].北京：科學出版社， 1996.

[2] 金仕勇， 陳仕江.日本醫(yī)蛭適宜飼養(yǎng)密度的研究[J].重慶中草藥研究，2003（1）：12-13.

[3] 石萍， 魯增輝， 賀元川， 等.水蛭（日本醫(yī)蛭）繁殖性能的研究[J].中藥材， 2015，38（6）：1144-1147.

[4] 陳仕江， 金仕勇， 李黎.光合細菌凈化日本醫(yī)蛭養(yǎng)殖水體的研究[J].中藥材， 2001， 24（5）：323-324.

[5] 余米，劉嘉，周夢，等.日本醫(yī)蛭生境水質及生物學特性初探[J].中藥材，2019，42（12）：2782-2785.

[6] 石萍， 魯增輝， 游華建， 等.饑餓及恢復喂食對日本醫(yī)蛭腸道菌群多樣性的影響[J].水生生物學報， 2019， 43（3）：537-544.

[7] 陳亞莉，王貴虎，張全星，等.水蛭腸道微生物的研究進展[J].安徽農業(yè)科學，2015，43（15）：164-166.

[8] 程珊， 汪波， 肖凌， 等.基于蛋白免疫印跡的水蛭抗凝活性成分研究[J].世界科學技術-中醫(yī)藥現(xiàn)代化， 2019，21（4）：657-661.

[9] 丁釗， 肖凌， 龔元， 等.日本醫(yī)蛭凍干粉的質量標準研究[J].中國藥房， 2018，29（9）：1237-1241.

[10] 張和韡， 王麗萍.水蛭素的研究進展[J].中國中西醫(yī)結合腎病雜志， 2013， 14（1）：76-78.

[11] 陳華友， 邢自力， 李媛媛，等.凝血酶滴定法測定水蛭素活性的改進[J].生物技術， 2002， 12（6）：24-25.

[12] 羅奇，區(qū)又君，艾麗，等.溫度和pH對條石鯛幼魚消化酶活力的影響[J].熱帶海洋學報，2010，29（5）：154-158.

[13] 張甫英， 李辛夫.低pH對魚類胚胎發(fā)育、魚苗生長及鰓組織損傷影響的研究[J].水生生物學報，1992，16（2）：175-182，196.

[14] 強俊， 李瑞偉， 王輝.pH對奧尼羅非魚仔魚活力及仔、稚魚生長的影響[J].南方水產，2009，5（2）：69-73.

[15] 陳亞琴.水質硬度和pH值對神仙魚繁殖的影響[J].水利漁業(yè)， 2006， 26（4）：54，77.

[16] 鄭曙明， 吳青， 李玉宏， 等.pH和硬度對曼龍魚孵化率和稚魚成活率的影響[J].水利漁業(yè)， 1999（1）：6-7.

[17] 邵鄰相， 葉菲菲.水硬度對七彩神仙魚幼魚發(fā)育的影響[J].水產養(yǎng)殖， 2005， 26（3）：40-42.

[18] CHARLES A L，MARKICH S J，STAUBER J L，et al.The effect of water hardness on the toxicity of uranium to a tropical freshwater alga （Chlorella sp.）[J].Aquatic toxicology， 2002， 60（1/2）：61-73.

[19] YIM J H，KIM K W，KIM S D.Effect of hardness on acute toxicity of metal mixtures using Daphnia magna.Prediction of acid mine drainage toxicity[J].Journal of hazardous materials， 2006， 138（1）：16-21.

[20] 李波， 樊啟學， 楊凱， 等.慢性氨氮脅迫對黃顙魚攝食、生長及血液指標的影響[J].應用與環(huán)境生物學報， 2011， 17（6）：824-828.

[21] 黃厚見.攝食水平、氨氮脅迫對梭魚幼魚生長的影響及其毒理效應研究[D].上海：上海海洋大學， 2012.

[22] 李冰寧， 歐陽杰， 武彥文，等.水蛭素檢測方法研究進展[J].藥物分析雜志， 2010，30（4）：755-760.

[23] 吳志軍， 張靈霞， 于立華.四種不同品種水蛭生物活性的研究與比較[J].中成藥， 2006， 28（2）：232-234.

[24] 李軍， 于翔， 張健，等.4種水蛭粗提物抗凝活性及凍存時間對菲牛蛭抗凝活性影響[J].水產科學， 2014，33（9）：591-593.

[25] 汪文茉， 張秋海， 歐興長.水蛭頭、尾抗凝活性的比較及晾干后對活性的影響[J].中國中藥雜志， 1998，23（3）：176.

[26] 劉君， 張麗艷.螞蟥藥材頭部與尾部抗凝活性比較研究[J].長春中醫(yī)藥大學學報， 2014， 30（3）：407-408.