高效液相色譜法測定雞蛋中磺胺類藥物殘留

馬世柱 陳楠 黎小鵬 周嘉誠 梁錦填 高文彬 林俊杰

摘要 本文應(yīng)用高效液相色譜法檢測雞蛋全蛋中磺胺嘧啶（SD）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺甲氧嗪（SMP）、磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺甲噁唑（SMZ）、磺胺地索辛（SDM）和磺胺喹噁啉（SQ）7種磺胺類藥物（SAs），并對(duì)提取、凈化等前處理?xiàng)l件以及檢測條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，雞蛋樣品中的磺胺類藥物適宜采用乙酸乙酯進(jìn)行提取，35 ℃減壓旋蒸濃縮至近干，經(jīng)水飽和正己烷洗滌凈化或堿性氧化鋁SPE凈化均可以除去大部分雞蛋中的干擾物，滿足檢測要求；以0.1%磷酸∶乙腈（V∶V=80∶20）作為流動(dòng)相，20 min內(nèi)7種磺胺類藥物均能達(dá)到基線分離。本方法提取效果良好，結(jié)果重復(fù)性及回收率滿足實(shí)際檢測需求，2種凈化方法使用靈活，適合于雞蛋中7種磺胺類藥物殘留量的測定。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法；雞蛋；磺胺類藥物；殘留

中圖分類號(hào) O657.7+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2018）11-0235-02

Abstract In this paper，7 kinds of sulfonamides（SAs），such as pyrimidine（SD），sulfamethazine（SM2），sulfamethoxypyridazine（SMP），sulfa-monomethoxine（SMM），sulfamethoxazole（SMZ），sulfadimethoxine（SDM） and sulfaquinoxaline（SQ）were detected by HPLC method，and the extra-ction and purification conditions and testing conditions were optimized.The results showed that the sulfonamides in egg samples were suitable to be extracted by ethyl acetate，decompressed and evaporated to dryness at 35 ℃.Water saturated hexane scrubbing or alkaline alumina SPE purification could remove most of the interferents in eggs and meet the detection requirements.Using 0.1% phosphoric acid ∶ acetonitrile（V∶V=80∶20）as the mobile phase， 7 kinds of sulfonamides were able to achieve the baseline separation in 20 min.The extraction effect was good by this method，and repeatability and recovery rate of the result met the actual detection requirements.The 2 kinds of purification methods were flexible and suitable for the determination of 7 kinds of sulfonamides residues in eggs.

Key words HPLC；egg；sulfonamides；residue

隨著人們生活水平的日益提高，人們對(duì)動(dòng)物性食品的衛(wèi)生質(zhì)量與安全的要求也越來越高，不僅對(duì)營養(yǎng)與味道要求高，還要求食品衛(wèi)生且經(jīng)濟(jì)。一方面，獸藥（其中包括添加劑）除保障動(dòng)物健康生長以外，還可以降低動(dòng)物發(fā)病率以及死亡率，同時(shí)提高飼料的利用率，促進(jìn)動(dòng)物的生長發(fā)育并改善動(dòng)物產(chǎn)品的品質(zhì)；但是另一方面，獸藥的使用又會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物性食品中含有獸藥殘留，這種殘留會(huì)給人體的健康帶來不可逆轉(zhuǎn)的危害。因此，獸藥殘留問題也日益受到了世界各國的重視。

磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）是一種化學(xué)合成抗生素，其基本母核是對(duì)氨基苯磺酰胺，是具有這一類共同母核的藥物總稱[1]。隨著經(jīng)濟(jì)的日益增長，供過于求的市場現(xiàn)狀促進(jìn)了現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的集約化、規(guī)?；约皹?biāo)準(zhǔn)化發(fā)展，這使得獸藥特別是磺胺類藥物在水產(chǎn)品養(yǎng)殖等行業(yè)的使用量大大加大。而在我國，限用藥物、非法藥物濫用現(xiàn)象屢見不鮮，這引發(fā)了我國食品安全事件頻發(fā)的嚴(yán)重后果[2]。因此，研究動(dòng)物性獸藥殘留的檢測方法變得尤為重要，我國也在繼續(xù)改進(jìn)相關(guān)方面的技術(shù)檢測，以防止重大食品安全事故的發(fā)生。因此，對(duì)SAs的化學(xué)性質(zhì)、作用機(jī)理及其殘留與檢測方法的研究是關(guān)系到畜牧業(yè)健康發(fā)展的重要問題之一[3]。本文應(yīng)用高效液相色譜法，對(duì)雞蛋全蛋中磺胺嘧啶（SD）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺甲氧嗪（SMP）、磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺甲噁唑（SMZ）、磺胺地索辛（SDM）和磺胺喹噁啉（SQ）7種SAs的前處理及儀器檢測條件進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent高效液相色譜儀（HPLC-DAD）；多功能超純水系統(tǒng)（S20，Spring）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（含真空泵，IKA-RV10，IKA）；臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（A2316R，上海安戈儀器有限公司）；固相萃取裝置（天津奧特賽思儀器有限公司）；多功能超純水系統(tǒng)（Spring-S20，廈門銳思捷科學(xué)儀器有限公司）；百分之一電子天平（CP2102，Ohaus）。

樣品前處理采用的乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、無水硫酸鈉、鹽酸均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；流動(dòng)相采用的0.1%磷酸水溶液和乙腈混合液均為色譜純，德國默克化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；0.22 μm有機(jī)濾膜，天津津騰實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司生產(chǎn)。標(biāo)準(zhǔn)品均由農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所生產(chǎn)，濃度均為100 mg/L，使用前用甲醇將其稀釋成所需濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的提取與凈化。

（1）取雞蛋5.00 g±0.05 g于50 mL離心管，加入20 mL乙酸乙酯和8 g無水硫酸鈉，渦旋振蕩2 min（或搖床振蕩15 min），5 000 r/min冷凍離心5 min，用一次性塑料吸管取上層清液移入50 mL圓底燒瓶。雞蛋殘?jiān)屑尤?0 mL乙酸乙酯重復(fù)提取，用玻璃棒攪勻結(jié)塊殘?jiān)?，并用少量乙酸乙酯洗滌玻璃棒，之后倒入離心管，渦旋振蕩2 min（或搖床振蕩15 min），5 000 r/min離心5 min，合并乙酸乙酯層，35 ℃減壓旋蒸至近干[4]。

（2）向圓底燒瓶中加入5.00 mL 流動(dòng)相[0.1%磷酸水溶液∶乙腈（V∶V=80∶20）]，混勻超聲1 min，移入15 mL離心管，向離心管中加入8 mL水飽和正己烷，渦旋混勻1 min，5 000 r/min離心5 min，棄去上層正己烷，重復(fù)上述操作1次后取2 mL下層清液，過0.20 μm濾膜，棄去前幾滴溶液后轉(zhuǎn)入2 mL樣品瓶供HPLC-DAD分析。

1.2.2 色譜條件。色譜柱為ZORBAX SB-C18柱，150 mm×4.6 mm，粒徑5.0 ？滋m；流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液∶乙腈（V∶V=80∶20）；柱溫為25 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量取50 ？滋L；檢測器使用DAD檢測器，檢測波長為270 nm，采集時(shí)長為20 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

水產(chǎn)品中SAs殘留檢測的流動(dòng)相一般采用乙酸水與甲醇或乙腈按一定比例混合[5]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的測定磺胺類藥物的反相HPLC流動(dòng)相體系[6-7]、農(nóng)牧發(fā)〔2001〕38號(hào)《動(dòng)物源食品中磺胺類藥物殘留的檢測方法-高效液相色譜法》[8]的磷酸水-乙腈體系，同時(shí)參考多個(gè)流動(dòng)相體系進(jìn)行色譜方法優(yōu)化試驗(yàn)，并比較了不同濃度及比例的磷酸、乙酸、甲酸水與乙腈流動(dòng)相體系。結(jié)果表明，水相pH值越低或有機(jī)相比例越高，均會(huì)提前目標(biāo)物的出峰位置，但同時(shí)也造成部分藥物基線分離較差，甚至保留時(shí)間重疊，對(duì)比多組數(shù)據(jù)結(jié)果，選取了0.1%磷酸水溶液∶乙腈（V∶V=80∶20）作為流動(dòng)相，在25 ℃柱溫條件和1 mL/min流速下，7種SAs能達(dá)到基線分離，峰型尖銳，峰對(duì)稱性較好。7種SAs的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1。

2.2 線性范圍和檢出限

在20～500 μg/L濃度范圍內(nèi)，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（x）為橫坐標(biāo)，根據(jù)五點(diǎn)校正法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得出標(biāo)準(zhǔn)曲線在20～500 μg/L濃度范圍內(nèi)7種SAs的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，以3倍信噪比來確定檢測限，10倍信噪比來確定定量限，結(jié)果見表1。

由表1可知，該儀器方法測定7種SAs在20～500 μg/L內(nèi)線性優(yōu)異，SAs的相關(guān)系數(shù)在0.999 63～0.999 99之間，其線性響應(yīng)范圍完全滿足檢測的要求，說明該儀器方法用于定量檢測具有很好的可靠性。

2.3 回收率和精密度

通過在空白樣品中添加不同濃度的SAs，以樣品加標(biāo)回收率和樣品結(jié)果重復(fù)性來評(píng)價(jià)方法的可靠性。選擇100、40、20 μg/kg共3個(gè)添加濃度進(jìn)行試驗(yàn)，按照2種凈化方法同時(shí)進(jìn)行同一添加濃度的前處理試驗(yàn)，每個(gè)添加濃度做6個(gè)平行加標(biāo)樣，計(jì)算結(jié)果扣除樣品空白，測定結(jié)果用平行測定后的算術(shù)平均值表示，保留3位有效數(shù)字，并計(jì)算求得平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，見表2。

由表2可知，2種凈化方法總體上均獲得了良好的回收率，RSD值均<10%，說明2種方法的重現(xiàn)性符合要求，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以滿足雞蛋中SAs含量檢測的要求。

3 結(jié)論

本文應(yīng)用高效液相色譜法，對(duì)雞蛋全蛋中磺胺嘧啶（SD）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺甲氧嗪（SMP）、磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺甲噁唑（SMZ）、磺胺地索辛（SDM）和磺胺喹噁啉（SQ）7種SAs的前處理及儀器檢測條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，雞蛋樣品中的SAs采用乙酸乙酯振蕩提取，無水硫酸鈉脫水鹽析，提取液經(jīng)35 ℃減壓旋蒸濃縮，復(fù)溶物通過水飽和正己烷洗滌或堿性氧化鋁SPE凈化后，均可以除去雞蛋樣品中大部分的色素、蛋白質(zhì)及脂肪，滿足HPLC-DAD檢測要求；色譜條件以0.1%磷酸∶乙腈（V∶V=80∶20）作為流動(dòng)相，7種SAs均能達(dá)到基線分離，2種凈化方法的回收率良好，其中SPE凈化法檢測限為3.35～17.84 μg/kg，定量限低于60 μg/kg。本方法提取效果良好，結(jié)果重復(fù)性及回收率滿足實(shí)際檢測需求，適合于雞蛋中7種SAs殘留量的測定。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 張艷，李彥文，莫測輝，等.高效液相色譜-熒光測定蔬菜中喹諾酮類抗生素[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（6）：176-180.

[2] 于淼.養(yǎng)殖業(yè)中磺胺類藥物殘留的危害及現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代畜牧科技，2015（2）：133-134.

[3] 姜正軍，霍蘭芝.我國蛋品加工業(yè)的現(xiàn)狀與對(duì)策[J].食品科技，2011（3）：4-6.

[4] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).畜禽肉中十六種磺胺類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法：GB/T 20759-2006[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

[5] 農(nóng)業(yè)部，衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物性食品中13種磺胺類藥物多殘留的測定 高效液相色譜法：GB 29694-2013[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

[6] JIANG S，ZHAO Y，JIN Y，et al.UHPLC-MS/MS Determination of Resi-dual Amounts of 19 Veterinary Drugs in Animal Tissues[J].Physical Test-ing & Chenmical Analysis，2010，46（11）：1319-1322.

[7] CHANTARATEEPRA P，SIANGPROH W，MOTOMIZU S，et al.Autom-ated Online Solid-Phase Extraction Coupled with Sequential Injection-HPLC-EC System for the Determination of Sulfonamides in Shrimp[J].International Journal of Electrochemistry，2012（10）：1-9.

[8] 農(nóng)業(yè)部.雞蛋中磺胺喹噁啉殘留檢測高效液相色譜法：農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-15-2008[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.