半枝蓮提取物對小鼠Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的治療作用

彭勇，龔瓊瑤，鄒榮鑫，黃海燕，應(yīng)穎，耿保慶，陳勇

半枝蓮為唇形科黃芩屬植物，具有抗炎癥、免疫調(diào)節(jié)、解熱、抗腫瘤、抗菌及抗氧化等藥理作用[1]。半枝蓮提取物具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[2]，還具有抗炎癥及免疫調(diào)節(jié)的作用[3]。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）系一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的自身免疫性疾病?；罨腞A成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）在RA炎癥的發(fā)生和發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用，其具有異常增殖、遷移和浸潤等類似腫瘤細(xì)胞樣的生物學(xué)特性[4]。此外，RA患者的血清和炎癥關(guān)節(jié)中存在著大量的炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-（TNF-）、白細(xì)胞介素-1（IL-1 ）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）及白細(xì)胞介素-33（IL-33）等，這些炎癥因子參與RA關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)及關(guān)節(jié)破壞的進(jìn)程。因此，本研究通過研究半枝蓮提取物對CIA小鼠模型關(guān)節(jié)炎癥狀況、關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化情況及血清細(xì)胞因子的表達(dá)水平等指標(biāo)的影響，探討其對RA小鼠的治療作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級近交系DBA/1小鼠，6～8周齡，雄性，體質(zhì)量18～20 g，購自于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[許可證號：SCXK(滬)2012-0002，合格證編號：2007000564939]，于寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守單位機(jī)構(gòu)動(dòng)物倫理學(xué)委員會的倫理學(xué)指南進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 半枝蓮提取物購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，完全弗氏佐劑（CFA）和不完全弗氏佐劑（FA）均為sigma公司產(chǎn)品，牛Ⅱ型膠原蛋白（CII）為Chondrex公司產(chǎn)品，ELISA試劑盒購自上海依科賽生物制品有限公司。

1.3 構(gòu)建RADBA/1小鼠模型及分組訂購100只SPF級DBA/1小鼠，SPF級飼養(yǎng)1周，讓小鼠熟悉環(huán)境；對小鼠進(jìn)行編號，并隨機(jī)分為5組：完全對照組、0.9%氯化鈉注射液對照組以及半枝蓮低、中、高劑量治療組，每組20只。完全對照組不作任何處理。其他組小鼠建立CIA模型：將2 mg/ml CII與1 mg/ml CFA等體積在冰浴中混合、乳化。于每只小鼠尾根部皮下注射150 l該乳化劑進(jìn)行造模，并記為造模第0天。造模第21天，將CII與CFA等體積混合、乳化，再次將該乳化劑150 l注射于小鼠尾根部皮下，強(qiáng)免疫1次。

1.4 給藥觀察 造模第22天開始造模小鼠灌胃給藥：半枝蓮低、中、高劑量治療組分別通過灌胃給予半枝蓮提取物30、60、90mg/次（用 0.9%氯化鈉注射液配制），0.9%氯化鈉注射液對照組及完全對照組，同步0.9%氯化鈉注射液灌胃。每天1次，連續(xù)21 d。分別于造模第28和49天進(jìn)行小鼠關(guān)節(jié)炎癥狀況評價(jià)：前后抓足掌厚度測定和關(guān)節(jié)炎評分兩方面。關(guān)節(jié)炎評分標(biāo)準(zhǔn)：正常為0分；輕微的但有明確的發(fā)紅和腕關(guān)節(jié)或踝關(guān)節(jié)發(fā)炎為1分；中等程度的發(fā)紅和腕關(guān)節(jié)或踝關(guān)節(jié)發(fā)炎為2分；整個(gè)爪子包括腳趾嚴(yán)重的發(fā)紅發(fā)炎記為3分：涉及多關(guān)節(jié)，四肢的最大程度的紅腫、關(guān)節(jié)變形、功能損傷為4分[5]。四只爪子得分相加為小鼠關(guān)節(jié)炎總評分。

1.5 血清內(nèi)細(xì)胞因子檢測 造模第49天摘眼球取血1 ml，分離血清，檢測各組小鼠血清IL-1 、IL-6、IL-33、TNF-和白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑（IL-1Ra）的水平。

1.6 關(guān)節(jié)病理切片的制備 于造模第49天取小鼠左、右后肢，剔除皮毛及結(jié)締組織，保留肌肉組織，浸泡在4%甲醛溶液中進(jìn)行組織固定，石蠟包埋，切片，HE染色，封片，病理分析，對于關(guān)節(jié)病理進(jìn)行半定量評分。每個(gè)關(guān)節(jié)的半定量評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)正常；1分，輕度的關(guān)節(jié)炎癥并有滑膜增生，血管數(shù)量增加，以及小的炎癥細(xì)胞灶，無軟骨和骨的侵蝕破壞；2分，關(guān)節(jié)有軟骨的侵蝕破壞，中度的關(guān)節(jié)炎癥，大量的炎癥細(xì)胞浸潤，滑膜細(xì)胞增生、血管翳形成較嚴(yán)重，骨和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)無破壞；3分，有嚴(yán)重的血管翳形成，廣泛的軟骨侵蝕破壞，可見骨破壞，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞[5]。兩只后肢得分相加為小鼠關(guān)節(jié)病理總評分。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析，多重比較采用LSD-法；兩組比較采用 檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CIA小鼠關(guān)節(jié)炎模型的建立 在造模第14天首次觀察到小鼠發(fā)病，第28天左右小鼠大規(guī)模發(fā)病，建模成功的CIA小鼠的足趾關(guān)節(jié)較對完全對照組小鼠的明顯紅腫。

2.2 小鼠關(guān)節(jié)炎癥狀況評價(jià)檢測 造模第28天，4組造模組小鼠的足掌厚度明顯高于完全對照組（均＜ 0.05），各造模組小鼠的足掌厚度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。造模第49天，4組造模組小鼠的足掌厚度明顯高于完全對照組（均＜0.05），中、高劑量半枝蓮治療組小鼠的足掌厚度低于 0.9%氯化鈉注射液對照組（均＜0.05）。見表1。造模第28天，4組造模組小鼠的關(guān)節(jié)炎評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；造模第49天，中、高劑量半枝蓮治療組小鼠的節(jié)炎評分低于0.9%氯化鈉注射液對照組及半枝蓮低劑量治療組（均＜ 0.05）。見表 2。

2.3 血清內(nèi)細(xì)胞因子檢測 造模第49天，0.9%氯化鈉注射液對照組小鼠血清中炎癥因子IL-1 、IL-6、IL-33、TNF- 及抑炎因子 IL-1Ra的水平均高于完全對照組小鼠（均＜0.05)。半枝蓮低劑量治療組小鼠血清中炎癥因子IL-1、IL-6及IL-33的表達(dá)水平與0.9%氯化鈉注射液對照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＞0.05），TNF-水平低于0.9%氯化鈉注射液對照組（＜0.05），IL-1R 高于0.9%氯化鈉注射液對照組（＜0.05)。半枝蓮中、高劑量治療組小鼠血清中炎癥因子IL-1 、IL-6、IL-33、TNF- 表達(dá)水平均低于0.9%氯化鈉注射液對照組（均＜0.05），半枝蓮高劑量治療組低于半枝蓮中劑量治療組（均＜0.05）。半枝蓮低、中、高劑量治療組小鼠血清中抑炎因子IL-1Ra的水平均高于完全對照組及0.9%氯化鈉注射液對照組（均＜0.05）。見表3。

2.4 病理結(jié)果分析 完全對照組小鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)正常（封三彩圖8A），病理評分為0分。0.9%氯化鈉注射液對照組小鼠關(guān)節(jié)呈現(xiàn)典型RA表現(xiàn)，可見大量滑膜細(xì)胞增生、炎性細(xì)胞浸潤及血管翳形成，見廣泛的軟骨和骨侵蝕破壞，關(guān)節(jié)正常生理結(jié)構(gòu)消失，關(guān)節(jié)面融合（封三彩圖8 B）。半枝蓮提取物低劑量治療組與0.9%氯化鈉注射液對照組僅關(guān)節(jié)間隙有所改善（封三彩圖8C），病理評分與0.9%氯化鈉注射液對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。半枝蓮提取物中劑量治療組小鼠關(guān)節(jié)間隙仍有狹窄，可見大量的炎癥細(xì)胞浸潤，滑膜細(xì)胞增生、血管翳形成較嚴(yán)重，可見軟骨的侵蝕破壞，但骨和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)存在（封三彩圖8D），病理評分較0.9%氯化鈉注射液對照組改善（＜0.05）。半枝蓮提取物高劑量治療組小鼠關(guān)節(jié)腔結(jié)構(gòu)基本正常，未見明顯骨質(zhì)破壞及血管翳形成，可見輕度炎性細(xì)胞浸潤、滑膜增生，僅部分關(guān)節(jié)可見軟骨輕微侵蝕破壞（封三彩圖8E），病理評分較0.9%氯化鈉注射液對照組改善（＜0.05）。見表 4。

表1 各組小鼠足掌厚度比較 cm

表2 各組小鼠關(guān)節(jié)炎評分比較 分

表3 各組小鼠血清中細(xì)胞因子檢測結(jié)果比較 pg/ml

3 討論

RA是一種由多種免疫細(xì)胞參與的全身性自身免疫性疾病，最終將導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞。目前對于RA發(fā)病機(jī)制并不十分清楚，其基本病理表現(xiàn)為滑膜炎，F(xiàn)LS在RA的滑膜異常增生及骨侵蝕中起著關(guān)鍵性作用[6]。FLS類似腫瘤細(xì)胞樣的生物學(xué)特性表現(xiàn)為異常增殖、遷移和浸潤及抗凋亡[7]；此外，還有調(diào)節(jié)炎性因子分泌的作用，如調(diào)節(jié)TNF-、IL-1、IL-6和IL-13等細(xì)胞因子[8]。這些炎癥因子是 RA 發(fā)病機(jī)制中重要的炎性因子[9]。IL-1Ra與IL-1受體結(jié)合后抑制IL-1信號復(fù)合物的形成，是一個(gè)重要的負(fù)性調(diào)節(jié)[10]，在RA中起到一定程度的保護(hù)作用。

半枝蓮及其提取物均具有良好的抗腫瘤活性且療效確切。Jiang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，半枝蓮可以通過下調(diào)IL-6表達(dá)水平，抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的STAT3信號通路，最終抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的異常增殖并促進(jìn)其凋亡，達(dá)到抗腫瘤作用。在肺癌小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，半枝蓮可顯著抑制荷瘤小鼠血清中IL-17、IL-10和IL-6表達(dá)水平，上調(diào)IL-2和干擾素-（IFN-）水平，并通過調(diào)節(jié)荷瘤小鼠的免疫功能而抑制體內(nèi)腫瘤生長[12]。此外，有研究還發(fā)現(xiàn)，給予半枝蓮治療的糖尿病小鼠，其視網(wǎng)膜中TNF-和IL-1的mRNA表達(dá)水平及血清中TNF-和IL-1表達(dá)水平均受到顯著抑制，半枝蓮?fù)ㄟ^預(yù)防糖尿病小鼠的視網(wǎng)膜炎癥進(jìn)而防止糖尿病視網(wǎng)膜病變[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，中、高劑量半枝蓮提取物可有效減輕 CIA小鼠關(guān)節(jié)腫脹程度，有效改善小鼠關(guān)節(jié)炎評分，并呈現(xiàn)劑量依賴性。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)半枝蓮提取物可顯著抑制 CIA小鼠血清中炎癥因子IL-1、IL-6、IL-33、TNF-的表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)了炎癥負(fù)性調(diào)節(jié)IL-1Ra表達(dá)水平，同樣呈現(xiàn)了劑量依賴性。本研究還發(fā)現(xiàn)：中、高劑量半枝蓮提取物可降低CIA小鼠關(guān)節(jié)病理評分，可有效減輕CIA小鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增生、炎性細(xì)胞浸潤及血管翳形成，延緩關(guān)節(jié)軟骨和骨侵蝕破壞，保護(hù)小鼠關(guān)節(jié)正常生理結(jié)構(gòu)，總體改善CIA小鼠關(guān)節(jié)病理情況，與關(guān)節(jié)炎評價(jià)中足掌厚度結(jié)果、關(guān)節(jié)炎評分結(jié)果一致。

綜上所述，半枝蓮提取物可有效地減輕CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥，改善CIA小鼠關(guān)節(jié)病理情況，對RA小鼠具有治療作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制IL-1、IL-6、IL-33、TNF- 等炎癥因子表達(dá)，并上調(diào)抑炎因子IL-1Ra的水平來實(shí)現(xiàn)的。但本文也僅初步探討研究了半枝蓮提取物對CIA小鼠的治療作用，其具體作用機(jī)制尚不清楚，這有待進(jìn)一步研究。

表4 各組小鼠關(guān)節(jié)病理評分結(jié)果比較 分