4種特殊染色法在肝臟穿刺活檢病理學(xué)檢查中的應(yīng)用比較

李萍，叢玲華，鐘國(guó)平，王玲娣

慢性肝病是我國(guó)患病率較高的疾病，尤以乙型肝炎（乙肝）最為常見(jiàn)。如不及時(shí)治療，部分患者隨著病情進(jìn)展容易轉(zhuǎn)化為肝硬化、肝功能衰竭甚至肝癌[1]。其中肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生導(dǎo)致的肝纖維化，是慢性肝炎向肝硬化甚至肝功能衰竭發(fā)展的重要階段，病理組織學(xué)檢查是評(píng)定炎癥及纖維化程度最為準(zhǔn)確的方法[2]。免疫組化染色法敏感性高、特異性強(qiáng)，但該方法成本高，且很多基層醫(yī)院由于條件限制無(wú)法開(kāi)展免疫組化檢驗(yàn)。本文收集55例慢性肝病患者，應(yīng)用 Masson、Gomori、銅鹽及含鐵血黃素4種特殊組織染色法對(duì)肝穿刺組織進(jìn)行病理組織學(xué)結(jié)構(gòu)觀察，探討各方法的染色陽(yáng)性檢出率，以及特殊染色法在肝穿刺組織中的診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 收集55例各種慢性肝病肝穿刺組織的石蠟包埋組織切片，來(lái)源為寧波市鄞州人民醫(yī)院病理室的肝活檢標(biāo)本，切取石蠟包埋切片作Masson、Gomori、銅鹽及含鐵血黃素染色。所有患者均依據(jù)2015年《中國(guó)慢性乙肝防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷，55例中慢性肝炎22例（輕度15例、中重度7例），免疫性肝損傷8例，肝硬化15例（早期肝硬化7例），肝臟腫瘤10例。相關(guān)試劑：Masson染色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)公司），Gomori染色試劑盒（珠海貝索生物技術(shù)有限公司），銅鹽染色液（Solarbio公司），含鐵血黃素染色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)公司）。

1.2 方法

1.2.1 Masson染色 將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水充分沖洗，用0.25%高錳酸鉀氧化5 min，2%草酸漂白，Masson復(fù)合液浸染10 min，用0.2%醋酸水沖洗，光綠液浸染5min，用0.2%醋酸水沖洗，后脫水、透明及封片。

1.2.2 Gomori染色方法 將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水充分沖洗，高錳酸鉀氧化5min，2%草酸漂白，水洗，2%硫酸鐵銨媒染2min，ddH2O沖洗，氨性銀液1 min，ddH2O沖洗2次，20%甲醛還原5 min，ddH2O沖洗2次，0.2%氯化金1 min，ddH2O沖洗2次，麗春紅S苦味酸液復(fù)染3～5min，后脫水、透明及封固。

1.2.3 銅鹽染色 將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，切片入紅氨酸染色液，37℃水浴染色24h，70%乙醇及ddH2O分別沖洗，晾干，核固紅染色液染色1 min，ddH2O洗滌，后脫水、透明及封固。

1.2.4 含鐵血黃素染色 將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水充分沖洗，將亞鐵氰化鉀試劑（試劑A）和促染劑（試劑B）等量混合后滴加1滴（0.1 ml)于組織中孵育10～20 min，ddH2O 充分洗滌，滴加 1 滴（0.1 ml）中性紅復(fù)染液（試劑C）復(fù)染5～10min，ddH2O洗滌，后脫水、透明及封固。

2 結(jié)果

Masson染色陽(yáng)性結(jié)果為：在點(diǎn)狀壞死區(qū)可見(jiàn)染成綠色的膠原纖維增粗、融合（封三彩圖3）；Gomori染色陽(yáng)性結(jié)果為：網(wǎng)狀纖維有黑色沉積的銀顆粒，肝小葉內(nèi)網(wǎng)狀纖維支架構(gòu)，壞死區(qū)網(wǎng)狀支架塌陷、融合、深染，并形成向肝小葉內(nèi)延伸的寬窄不一的纖維間隔，局部形成假小葉（封三彩圖4）；銅鹽染色陽(yáng)性結(jié)果為：肝組織內(nèi)有彌漫性紅氨酸銅顆粒沉積，主要見(jiàn)于匯管區(qū)周圍變性肝細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，肝小葉內(nèi)其他部位也有少量的陽(yáng)性銅顆粒（封三彩圖5）。含鐵血黃素染色陽(yáng)性結(jié)果為：肝組織內(nèi)有大量彌漫性普魯士藍(lán)鐵顆粒沉積（封三彩圖6）。

4種染色方法對(duì)重癥肝病患者的陽(yáng)性檢出率均較高，如在9例肝細(xì)胞癌、8例肝硬化肝組織中均呈強(qiáng)陽(yáng)性；4種方法在免疫性肝損傷和慢性肝炎患者的檢出結(jié)果有所不同，6例免疫性肝損傷和6例慢性肝炎患者強(qiáng)陽(yáng)性、8例慢性肝炎患者弱陽(yáng)性（Masson染色法）；2例慢性肝炎患者強(qiáng)陽(yáng)性，5例免疫性肝損傷和9例慢性肝炎患者弱陽(yáng)性（銅鹽染色法）；7例免疫性肝損傷和5例慢性肝炎患者強(qiáng)陽(yáng)性，1例免疫性肝損傷和9例慢性肝炎患者弱陽(yáng)性（含鐵血黃素染色法）；5例免疫性肝損傷和5例慢性肝炎患者強(qiáng)陽(yáng)性，1例免疫性肝損傷和10例慢性肝炎患者弱陽(yáng)性（Gomori染色法）。見(jiàn)表1。

Masson染色和Gomori染色兩種方法靈敏度較高，尤其對(duì)于輕度肝病的檢出，較另外兩種方法陽(yáng)性率高，但Gomori染色相對(duì)較繁瑣，成本較高，在操作時(shí)間上，銅鹽染色法耗時(shí)較長(zhǎng)，且對(duì)于輕度肝病的陽(yáng)性檢出率較低。見(jiàn)表2。

3 討論

Masson法是經(jīng)典且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的膠原纖維染色法，膠原纖維色澤鮮艷，切片背景清晰，對(duì)比度強(qiáng)；能清楚的顯現(xiàn)出肝組織內(nèi)膠原纖維分布狀況、沉積增生以及匯管區(qū)周邊纖維增生情況，對(duì)于慢性肝炎纖維化程度、范圍及肝內(nèi)結(jié)構(gòu)改變的判斷都具有直觀性[3]。Masson法輔助HE染色在評(píng)價(jià)肝纖維化程度以及慢性乙肝、肝硬化病理學(xué)診斷中具有重要的應(yīng)用價(jià)值[4]。

網(wǎng)狀纖維是肝竇與肝細(xì)胞的主要支架[5]。Gomori染色法可將網(wǎng)狀纖維染成黑色網(wǎng)狀，用該染色方法可很好地顯示肝硬化再生結(jié)節(jié)的特征、增生病變、腫瘤及纖維化程度，也可定期評(píng)估非肝硬化門脈高壓癥的進(jìn)程。除早期高分化HCC之外，一般癌組織內(nèi)網(wǎng)狀纖維較少，與肝細(xì)胞腺瘤等的鑒別需結(jié)合其他方法[6]。

表1 55例不同肝病各染色陽(yáng)性檢出率比較 例（%）

表2 4種組織學(xué)染色方法比較

肝內(nèi)瘀血程度是判斷慢性乙肝及肝硬化病情加重的關(guān)鍵因素[7]。含鐵血黃素是一種血紅蛋白源性色素，是組織內(nèi)沉著的鐵質(zhì)的主要存在方式，含鐵血黃素染色法主要用以顯示和證明組織內(nèi)的各種局部出血性病變。免疫性肝損傷以及中、重度肝炎患者肝內(nèi)常有陳舊性出血，因此，采用含鐵血黃素染色法陽(yáng)性率較高。此方法對(duì)血色病、病毒性肝炎、酒精性肝病、肝硬化及肝血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷等引起的鐵蛋白色素顆粒增多均有很好的顯色效果[8]。

銅在正常人體組織內(nèi)含量極少，當(dāng)肝豆?fàn)詈俗冃曰蚋斡不瘯r(shí)，銅含量明顯增加，紅氨酸與銅鹽反應(yīng)生成的紅氨酸-二亞胺型銅鹽沉淀呈墨綠色；因此銅鹽染色法（紅氨酸法）適于診斷肝炎、肝硬化、藥物性肝損傷及原發(fā)性硬化性膽管炎等引起的肝細(xì)胞或膽管內(nèi)的膽色素增多，還可用于診斷和鑒別慢性膽汁淤積、Wilson病及 1-抗胰蛋白酶缺乏癥[9]。

特殊染色除了本文所用到的方法之外，還有可顯示彈性纖維和慢性B型肝炎中HBsAg的維多利亞藍(lán)染色，可顯示纖維板層型或透明細(xì)胞型HCC、酒精性肝病時(shí)出現(xiàn)的Mallory小體、阿米巴和真菌的PAS染色，可顯示慢性病毒性肝炎、肝硬化、原發(fā)性膽管炎及藥物性肝損傷所致的膽色素增多的Hall染色法等[9-10]。雖然特殊染色法溶液配制復(fù)雜，且檢驗(yàn)敏感性、信號(hào)特異性及背景清晰度雖不如免疫組化和分子病理學(xué)分析的技術(shù)；但其不需要特殊的儀器及設(shè)備，成本低，試劑便宜，可反復(fù)使用，特殊染色收費(fèi)不高，也更易被患者所接受，適于基層醫(yī)院或病情的初篩。