LXA4、TNF-及其比值與子癇前期發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究

王 莉，丁依玲

(1.海南省人民醫(yī)院產(chǎn)科，海南 ?？?570000；2.中南大學(xué)湘雅二院產(chǎn)科，湖南 長沙 410000)

子癇前期(preeclampsia，PE)的發(fā)生發(fā)展，特別是子癇的發(fā)生可以導(dǎo)致患者病死率的上升，并促進最終不良臨床結(jié)局的發(fā)生。流行病學(xué)研究顯示PE的發(fā)病率可達(dá)0.6%～1.8%，特別是在部分地區(qū)的人群中的發(fā)病率更高[1]。在探討PE發(fā)病機制的過程中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞炎癥因子等生物學(xué)因子激活導(dǎo)致的氧化應(yīng)激障礙或者代謝性損傷等，均可以促進PE患者的病情進展。脂氧素A4(lipoxin A4，LXA4)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-)等，可以通過激活下游炎癥因子IL-6等的上調(diào)，促進胎盤血管內(nèi)皮的損傷，加劇胎盤血管的螺旋化等重塑性障礙，導(dǎo)致血流動力學(xué)紊亂[2-4]。為了進一步揭示LXA4、TNF-在PE發(fā)病機制過程中的作用，本研究選取PE產(chǎn)婦78例，探討相關(guān)指標(biāo)在胎盤及血清中的異常表達(dá)，報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年2月至2017年2月在海南省人民醫(yī)院分娩的PE產(chǎn)婦78例，其中輕度PE產(chǎn)婦45例(輕度PE組)，重度PE產(chǎn)婦33例(重度PE組)，納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷符合謝幸等主編的《婦產(chǎn)科學(xué)》(第8版)標(biāo)準(zhǔn)；②自愿提供胎盤組織；③單胎妊娠初產(chǎn)婦；④產(chǎn)婦及家屬知情同意并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并胎膜早破、前置胎盤等產(chǎn)科其他合并癥；②有糖尿病、甲狀腺功能亢進、血液系統(tǒng)疾病等；③近1個月內(nèi)服用過抗炎藥物或免疫抑制類藥物。同時選取正常產(chǎn)婦50例作為對照組，對照組、輕度PE組和重度PE組產(chǎn)婦年齡、孕周、孕次等一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

組別例數(shù)(n)年齡(歲)孕周(周)孕次(次)對照組5026.03±3.4138.21±2.061.24±0.41輕度PE組4525.94±2.8038.04±1.971.20±0.24重度PE組3326.06±3.0438.17±2.161.31±0.34F1.0672.0441.874P>0.05>0.05>0.05

1.2酶聯(lián)免疫吸附測定

采取兩組患者靜脈血用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測LXA4、TNF-水平，采用低溫高速離心機進行離心，1 000r/min(離心半徑為15cm)，獲得血清后抽取50μL樣品加入96孔板內(nèi)，采用去離子水作為陰性對照，采用50μL磷酸鹽緩沖液作為陽性對照，平衡搖晃20s混勻，室溫下孵育2h，采用磷酸二鈉緩沖液(TBST)清洗3次，每次5min，加入100μL底物，平衡搖晃30～45s，25℃室溫下孵育40min，加入250μL終止物，直到96孔板中每孔的顏色變黃，最后以空白對照為基準(zhǔn)，采用分光光度計進行讀數(shù)。LXA4、TNF-抗體購自羅氏檢測公司，相關(guān)配套試劑購自南京凱基生物科技有限公司，嚴(yán)格按照說明書的要求進行操作。

1.3免疫組化檢測

采用石蠟切片脫蠟至水，切片厚度3mm，3%H2O2室溫孵育5min，采用去離子水沖洗3次，每次3min，采用濃度為10%牛奶蛋白(1g蛋白加入100mL純水)封閉，室溫孵育5min，加入LXA4受體和TNF-抗體(鼠來源，南京碧云天生物科技有限公司)，37℃孵育2h，PBS緩沖液沖洗3次，每次5min，滴加辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的二抗(兔來源，購自羅氏檢測公司)，37℃孵育30min，PBS沖洗3次，每次5min，加入溴甲酚紫指示劑，顯色5min，復(fù)染，脫水，透明，封片，鏡下觀察。OLIPICS電子顯微鏡購自上海精密儀器有限公司，配套試劑購自南京泰康生物科技有限公司。

1.4結(jié)果判斷

采用Fromowitz綜合計分法，蛋白陽性表達(dá)位于細(xì)胞胞漿內(nèi)，呈棕黃色顆粒。隨機選取5個高倍鏡視野，計數(shù)滋養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)陽性細(xì)胞比例計分，比例<25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強度為無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；總分=染色強度得分×細(xì)胞比例得分，>2分為陽性，≤2分為陰性。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1各組胎盤組織LXA4受體和TNF-表達(dá)

輕度PE組和重度PE組LXA4受體蛋白陽性表達(dá)率分別為55.55%和60.61%，明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為19.077、14.246，均P<0.05)，而TNF-蛋白陽性表達(dá)率分別為80.00%和81.82%，明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為25.688、23.035，均P<0.05)，見表2和圖1。

表2各組胎盤組織LXA4受體和TNF-表達(dá)[n(%)]

Table 2 Expressions of LXA4 receptor and TNF-in placenta in each group[n(%)]

Table 2 Expressions of LXA4 receptor and TNF-in placenta in each group[n(%)]

組別例數(shù)(n)LXA4受體蛋白陽性表達(dá)TNF-α蛋白陽性表達(dá)對照組5047(94.00)14(28.00)輕度PE組4525(55.55)a36(80.00)a重度PE組3320(60.61)a27(81.82)aχ220.10935.424P<0.05<0.05

注：a與對照組比較P<0.05。

注：A和D為對照組LXA4受體和TNF-表達(dá)；B和E為輕度PE組LXA4受體和TNF-表達(dá)；C和F為重度PE組LXA4受體和TNF-表達(dá)。

圖1免疫組化圖

Fig.1 Immunohistochemistry image

2.2各組血清LXA4、TNF-比較

輕度PE組血清LXA4明顯高于對照組和重度PE組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為12.163、10.476，均P<0.05)；輕度PE組和重度PE組TNF-明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為48.500、37.304，均P<0.05)；重度PE組LXA4/TNF-明顯低于對照組和輕度PE組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為25.271、16.106，均P<0.05)；輕度PE組LXA4/TNF-明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=16.970，P<0.05)，見表3。

2.3相關(guān)性分析

表3各組血清LXA4、TNF-比較

Table 3 Comparison of serum LXA4 and TNF-

Table 3 Comparison of serum LXA4 and TNF-

注：a與對照組比較P<0.05；b與重度PE組比較P<0.05。

3討論

3.1子癇前期的背景相關(guān)研究

飲食習(xí)慣的改變、遺傳易感因素及高脂血癥等，均可以促進子癇前期的發(fā)生發(fā)展，特別是在具有高血壓家族史的患者中，子癇前期的發(fā)病率可較普通對照人群上升3～4倍[5]。子癇前期的長期發(fā)展，可以導(dǎo)致孕產(chǎn)婦妊娠中晚期發(fā)生胎盤早剝、產(chǎn)后出血及產(chǎn)褥期并發(fā)癥的發(fā)生，臨床預(yù)后不佳。解痙、降壓、肝素抗凝等綜合性治療，雖然可以在一定程度上抑制病情的進展，但治療的總有效率不足35%，患者的病情進展率仍然可達(dá)40%以上。而對于子癇前期發(fā)病過程中的相關(guān)機制的探討，可以為疾病的生物學(xué)治療提供理論基礎(chǔ)，從而提高子癇前期的治療效果。

3.2 LXA4及TNF-α的異常表達(dá)與子癇前期發(fā)病的潛在關(guān)系

LXA4可以通過增加胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷，促進絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡和蛻膜組織的退行性病變，進而導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生發(fā)展。特別是對于胎盤血管的螺旋化、弓狀血管的重塑等生理過程的影響，可以導(dǎo)致胎盤血管的血流灌注阻力的增加，促進病情的進展[6-7]。TNF-作為細(xì)胞炎癥因子，其可以通過激活下游單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的上調(diào)，促進炎癥細(xì)胞對于胎盤組織的浸潤[8-10]，加劇了胎盤血管的螺旋化病理改變、促進血流動力學(xué)障礙，血流呈現(xiàn)出明顯的高阻力、低灌注表現(xiàn)，從而影響血壓波動[11-12]。已有的研究探討了LXA4及TNF-的異常表達(dá)，但多數(shù)研究局限于血清學(xué)資料的對比研究，缺乏對胎盤組織中相關(guān)蛋白水平的表達(dá)研究。

3.3 LXA4及TNF-α的異常表達(dá)在促進子癇前期患者病情進展過程中的作用

本研究發(fā)現(xiàn)，在胎盤組織中，LXA4受體的陽性表達(dá)水平較低，低于正常對照組人群，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示LXA4受體的異常表達(dá)可能促進了子癇前期患者的病情進展，LXA4受體數(shù)量或者敏感性的改變，可以通過影響胎盤組織的氧化應(yīng)激障礙、促進炎癥反應(yīng)等，進而導(dǎo)致血壓的波動，促進腎臟等多器官的損傷；在胎盤組織中，可發(fā)現(xiàn)TNF-蛋白的陽性表達(dá)率較高，高于正常對照人群，TNF-的高表達(dá)可以通過激活下游IL-6或IL-10等，加劇局部線粒體能量利用障礙，促進胎盤微血管的損傷。王素梅等[13]和張俊農(nóng)等[14]在探討重度子癇前期患者的發(fā)病機制的過程中發(fā)現(xiàn)，TNF-等的激活是促進PE患者病情進展的持續(xù)性核心因素，其中胎盤組織中TNF-的表達(dá)陽性率可平均上升25%以上，患者的血壓控制效果越差、病情越嚴(yán)重，相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)越高。在探討血清學(xué)相關(guān)指標(biāo)的改變過程中發(fā)現(xiàn)，輕度和重度PE組TNF-明顯高于對照組，TNF-在胎盤組織或者血清中均呈現(xiàn)出明顯的高表達(dá)趨勢，提示TNF-的表達(dá)能夠顯著促進患者病情的進展，這主要由于TNF-的表達(dá)提高了血管內(nèi)皮的損傷程度，進一步導(dǎo)致血管的痙攣和血壓的上升[12]。但本研究并未發(fā)現(xiàn)LXA4在血清中表現(xiàn)出同樣的低表達(dá)趨勢，結(jié)果顯示輕度PE組血清LXA4明顯高于對照組和重度PE組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，考慮可能與LXA4的受體敏感性或正反饋調(diào)控障礙等有關(guān)，也可能與本研究的樣本量較少有關(guān)。LXA4/TNF-可以有效評估患者的病情，重度組患者的LXA4/TNF-明顯低于輕度組，而輕度組LXA4/TNF-也明顯低于正常對照組。相關(guān)關(guān)系分析也發(fā)現(xiàn)，LXA4與TNF-具有密切的關(guān)系，同時LXA4/TNF-與PE患者病情呈負(fù)相關(guān)，患者的病情越嚴(yán)重，LXA4/TNF-的指標(biāo)越低。

3.4總結(jié)

本研究的創(chuàng)新性在于探討了LXA4受體水平的表達(dá)異常，同時揭示了胎盤組織中LXA4等因子的表達(dá)變化，相關(guān)關(guān)系分析也可以進一步揭示不同炎癥因子的致病機制。綜上所述，PE患者血清LXA4和TNF-，以及胎盤組織LXA4受體和TNF-表達(dá)異常，可能與疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其中LXA4/TNF-比值可在一定程度上反映病情程度。