叢枝菌根真菌異形根孢囊霉14-3-3蛋白基因的克隆及功能驗(yàn)證 1)

徐麗嬌 郝志鵬 李濤 李芳 李景龍 陳保冬

(城市與區(qū)域生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心)，北京，100085；中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京，100049)

叢枝菌根(AM)是真菌侵染植物根系形成的共生體，以真菌在根系皮層細(xì)胞內(nèi)形成叢枝狀結(jié)構(gòu)而得名[1]。AM真菌能與陸地生態(tài)系統(tǒng)中絕大多數(shù)植物種類形成共生，對(duì)于植物之間的養(yǎng)分交換、能量流動(dòng)、信息傳遞以及維持生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性和系統(tǒng)穩(wěn)定性，都具有不可替代的作用[2]。這種共生關(guān)系，不僅存在于普通環(huán)境中，也存在于干旱環(huán)境中。干旱脅迫下，根外菌絲與植物根系之間的高效運(yùn)輸通道為植物提供了便捷的營(yíng)養(yǎng)和水分吸收途徑，對(duì)維持植物生長(zhǎng)發(fā)育和生理過(guò)程起到重要作用[3]。當(dāng)前，全球干旱事件頻發(fā)，干旱地區(qū)逐年擴(kuò)大，對(duì)人類的生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展造成了極大的影響。這也促使人們更加關(guān)注干旱環(huán)境下AM對(duì)植物水分代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制，尋找維持植物生長(zhǎng)和生態(tài)系統(tǒng)平衡的技術(shù)途徑。

在干旱脅迫信號(hào)傳導(dǎo)和響應(yīng)過(guò)程中，14-3-3蛋白作為一類重要的調(diào)節(jié)蛋白，逐漸引起了人們的研究興趣。14-3-3蛋白是高度保守并在真核生物中普遍存在的多基因蛋白質(zhì)家族，它對(duì)靶蛋白進(jìn)行特異性調(diào)控，并能參與細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)傳導(dǎo)和新陳代謝，影響植物生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程[4]。有研究表明，14-3-3蛋白不僅可以調(diào)控信號(hào)通路相關(guān)蛋白參與脅迫響應(yīng)，還可以通過(guò)調(diào)控幾種機(jī)制共同作用，改變生物響應(yīng)脅迫的新陳代謝過(guò)程[5]。14-3-3蛋白作為脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，在生物受到脅迫損傷后可以促進(jìn)DNA復(fù)制，對(duì)調(diào)控細(xì)胞周期至關(guān)重要[6]。在脅迫條件下，質(zhì)膜中14-3-3蛋白含量顯著升高，并伴隨著H+-ATP酶/14-3-3復(fù)合物數(shù)量的增加和ATP酶活性的增強(qiáng)[7]。鈣調(diào)蛋白激酶(CDPK)等干旱脅迫響應(yīng)蛋白也被確認(rèn)為14-3-3調(diào)節(jié)的目標(biāo)蛋白。擬南芥(Arabidopsisthaliana)中的CDPK1被證實(shí)受到14-3-3的調(diào)控，被激活后其Ca2+跨膜運(yùn)輸?shù)男始颖禰8]。

Porcel et al.[9]從AM真菌中首次克隆到1個(gè)14-3-3蛋白基因Gi14-3-3(現(xiàn)更名為Ri14-3-3)。Ri14-3-3蛋白基因在干旱脅迫下上調(diào)，調(diào)控植物干旱脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，最終增強(qiáng)植物抵御干旱脅迫的能力。Li et al.[10]證實(shí)，植物編碼d-myo-inositol3-磷酸合成酶(IPS)和14-3-3蛋白GF14(14-3GF)的基因被AM真菌調(diào)控，可以激活真菌Ri14-3-3和水孔蛋白基因PIPs的表達(dá)，提高玉米植株抗旱性。這些實(shí)驗(yàn)提供了AM真菌14-3-3蛋白增強(qiáng)植物抗旱性的分子證據(jù)，但是AM真菌14-3-3蛋白的功能仍然缺少直接驗(yàn)證。筆者在AM真菌異形根孢囊霉(Rhizophagusirregularis)DAOM 197198中克隆到了14-3-3蛋白基因Ri14-3-3，將該基因轉(zhuǎn)到釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)177 w中，通過(guò)比較酵母的生長(zhǎng)曲線以及干旱響應(yīng)基因的表達(dá)情況，探討AM真菌14-3-3蛋白的功能及其對(duì)植物抗旱性的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)利用胡蘿卜毛根-AM真菌雙重?zé)o菌培養(yǎng)體系進(jìn)行，轉(zhuǎn)移發(fā)根土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)質(zhì)粒上的T-DNA(Ri T-DNA)至胡蘿卜(DaucuscarotaL.)根部得到胡蘿卜毛根[11]。胡蘿卜毛根與叢枝菌根真菌R.irregularisDAOM 197198雙重培養(yǎng)體系的建立參照文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行。AM真菌孢子先經(jīng)過(guò)吐溫80和氯胺T進(jìn)行表面消毒，然后用質(zhì)量濃度0.01 g/L的硫酸鏈霉素和質(zhì)量濃度0.005 g/L的硫酸慶大霉素清洗，最后在質(zhì)量濃度0.015 g/L的水瓊脂上面萌發(fā)。將轉(zhuǎn)移Ri T-DNA 并且能夠連續(xù)繼代培養(yǎng)的胡蘿卜毛根接種在固體基本培養(yǎng)基[13]上，然后在根尖部位接入10～15個(gè)萌發(fā)的AM真菌孢子，在25 ℃下黑暗培養(yǎng)。3個(gè)月后形成良好菌根共生，菌根生長(zhǎng)鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿即可進(jìn)行收獲。用鑷子收集AM真菌侵染的胡蘿卜毛根，超純水清洗3次后放入冰箱-80 ℃保存。

本研究選用的表達(dá)載體為pESC-HIS，是為酵母中真核生物基因的表達(dá)和功能分析而設(shè)計(jì)的標(biāo)記載體。pESC-HIS包含酵母篩選標(biāo)記HIS3，轉(zhuǎn)入表達(dá)載體的酵母可以在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基生長(zhǎng)。同時(shí),載體帶有的c-myc (EQKLISEEDL)2抗原標(biāo)記的序列位于GAL1啟動(dòng)子的下游多克隆位點(diǎn)中。目的基因可以插入c-myc抗原位點(diǎn)之前，根據(jù)c-myc標(biāo)記對(duì)目的蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢驗(yàn)。

選用的異源表達(dá)材料為S.cerevisiaeBY4742 177 w菌株。普通的S.cerevisiae中有2個(gè)14-3-3基因(BMH1和BMH2)，BY4742 177 w菌株是14-3-3基因的單倍體缺陷株，在該菌株中只有1個(gè)14-3-3蛋白基因BMH2。

圖1 pESC-HIS表達(dá)載體圖譜

1.2 RNA提取

取0.1 g胡蘿卜毛根樣品，采用TRIZOL(Invitrogen，美國(guó))提取根系總RNA。約0.2 g根在液氮中磨成粉末。將樣品在TRIzol中進(jìn)行勻漿后，加入氯仿，使勻漿液分為透明的上層水溶液層(含RNA)、中間層和紅色的有機(jī)層(含DNA和蛋白質(zhì))。用異丙醇沉淀出RNA，用于14-3-3蛋白基因的克隆。

1.3 Ri14-3-3基因克隆

總RNA提取完成后經(jīng)DNA酶消化，用于合成cDNA。合成體系為20 μL，使用的試劑盒為 Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific，上海)。析出的RNA洗凈，去除雜質(zhì)，然后再懸浮，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。cDNA用1 μg經(jīng)過(guò)DNA酶處理的總RNA合成，使用Prime Script?RT試劑盒(TAKARA Biotechnology Co. Ltd，大連)。根據(jù)說(shuō)明書(shū)，cDNAs在20 μL反應(yīng)體系中合成，包含200 U高保真反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)、20 U RNA酶抑制劑、1 μL dNTP混合物(10 mmol)、5倍反轉(zhuǎn)錄緩沖液。反轉(zhuǎn)錄后，每個(gè)cDNA溶液中添加80 μL超純水，最后獲得100 μL液體。使用Nanodrop?ND-2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(NanoDrop Technologies，美國(guó))檢測(cè)樣本cDNA濃度。

胡蘿卜根系cDNA利用高保真酶KOD FX(TOYOBO Life Science，日本)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，獲得基因全長(zhǎng)。使用引物為帶有BamH I和Sal I酶切位點(diǎn)的14-3-3基因全長(zhǎng)引物Ri14-3-3-F/R(見(jiàn)表1)。25 μL反應(yīng)體系含有1 μL模板cDNA、1 μmol特異性引物、2.5 μL緩沖液、2.5 μL dNTP、1 μL MgSO4、0.5 μL KOD高保真酶。反應(yīng)條件：①95 ℃ 5 min；②95 ℃ 30 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；③72 ℃ 10 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度10 g/L的瓊脂糖膠分離后，切割783 bp條帶，用快速凝膠提取試劑盒(Qiagen，美國(guó))純化。純化后的產(chǎn)物，分別連接到pGEM-T載體上(Promega Corp.，美國(guó))。將連接后的pGEM-T載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109感受態(tài)細(xì)胞中(TAKARA Biotechnology，大連)。目的質(zhì)粒經(jīng)大腸桿菌擴(kuò)增后，經(jīng)過(guò)藍(lán)白班篩選，得到含有目的載體的菌落。經(jīng)過(guò)測(cè)序，篩選含有目的基因的大腸桿菌，并提取質(zhì)粒。純化目的質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和Sal I(Fermentas，加拿大)酶切之后，獲得酶切后的Ri14-3-3開(kāi)放性閱讀框。

表1 AM真菌和釀酒酵母基因及實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

注：引物根據(jù)基因序列使用Primer 3.0設(shè)計(jì)。

1.4 Ri14-3-3蛋白基因在酵母中的異源表達(dá)

將帶有酶切位點(diǎn)的Ri14-3-3開(kāi)放性閱讀框，與經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和Sal I(Fermentas，加拿大)酶切后的表達(dá)載體pESC-HIS連接；插入GAL1啟動(dòng)子后，c-myc標(biāo)記之前。將連接后的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)；利用載體上帶有的ampicillin標(biāo)簽篩選，并提取連接正確的Ri14-3-3-pESC-HIS表達(dá)載體質(zhì)粒。將表達(dá)載體利用電穿孔法轉(zhuǎn)入S.cerevisiae177 w感受態(tài)細(xì)胞中。在對(duì)照試驗(yàn)中，將未連接目的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中。電擊完畢后，將菌體懸液涂布于缺少his的MD平板上。1 L MD-his培養(yǎng)基配制方法：稱取8 g MD-his培養(yǎng)基(泛基諾，YGM0003A，北京)加水950 mL，高壓后加50 mL質(zhì)量濃度為400 g/L過(guò)濾除菌的半乳糖，混勻后倒平板，冷卻凝固后使用。每200 μL涂布一塊平板；將平板置于30 ℃培養(yǎng)，直至單個(gè)菌落出現(xiàn)。用PCR驗(yàn)證帶有Ri14-3-3基因的菌株為所需的酵母異源表達(dá)菌株。

1.5 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)

蛋白提取采用蛋白提取試劑盒(C500013-0050，生工，上海)，按試劑盒步驟提取蛋白并進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，制備聚丙烯酰胺凝膠，濃縮膠5%、分離膠8%。聚丙稀酰胺凝膠電泳，膠凝后每孔上樣約50 μg，依次為預(yù)染的標(biāo)記物、空白對(duì)照組、14-3-3蛋白質(zhì)樣品。室溫下濃縮膠90 V，20 min；分離膠120 V，通過(guò)預(yù)染蛋白標(biāo)記確定電泳停止時(shí)間。孵育一抗：c-myc兔多克隆抗體(D110006，BBI)體積分?jǐn)?shù)5%，脫脂乳1∶1 000稀釋，4 ℃緩慢振蕩過(guò)夜，次日室溫孵育60 min。TBST洗膜4次，10 min/次。孵育二抗：兔抗Ig G/HRP(D110056-0100，BBI)，1∶8 000稀釋，37 ℃孵育60 min。洗膜：TBST洗膜4次，10 min/次。ECL曝光，圖像掃描進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。

1.6 轉(zhuǎn)入Ri14-3-3的釀酒酵母生長(zhǎng)曲線測(cè)量

酵母細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的測(cè)定，按如下步驟進(jìn)行：2種類型的轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，分別在100 mg·L-1氨芐青霉素的YPD中過(guò)夜，培養(yǎng)至吸光度(波長(zhǎng)600 nm)=0.2。取100 μL培養(yǎng)液，分別加到100 mL的YPD液體或者含有質(zhì)量濃度100 g/L聚乙二醇(PEG 6000)的培養(yǎng)基中。在30 ℃、200 r·min-1條件下，培養(yǎng)40 h。每個(gè)處理重復(fù)5次。在細(xì)胞培養(yǎng)期間，在12～40 h內(nèi)每隔2 h收獲細(xì)胞。在波長(zhǎng)600 nm條件下，用連續(xù)光譜酶標(biāo)儀(SPECTRA max190，MD，美國(guó))檢測(cè)細(xì)胞濃度變化。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)測(cè)量

實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)使用ABI 7500 Real-Time PCR 系統(tǒng)進(jìn)行(Applied Biosystems，福斯特)。定量PCR體系為25 μL，其中包含5 μL模板cDNA和1 μmol特異性引物、12.5 μL SYBR?Premix ExTaq(TAKARA Biotechnology Co. Ltd，大連)。定量PCR程序：①95 ℃ 5 min；②95 ℃ 30 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。60 ℃收集熒光數(shù)據(jù)。用溶解曲線分析對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性進(jìn)行檢驗(yàn)，溶解曲線分析程序?yàn)椋?0 ℃ 10 s，然后以0.5 ℃·s-1的升溫速率加熱到100 ℃，數(shù)據(jù)連續(xù)收集。以釀酒酵母基因UBC6作內(nèi)參基因(見(jiàn)表1)。每個(gè)樣品做3個(gè)平行，Ct值偏差小于0.5個(gè)周期，相同的cDNA轉(zhuǎn)錄的相對(duì)水平通過(guò)2-ΔΔCt方法計(jì)算[14]。在對(duì)照試驗(yàn)中，分別在反應(yīng)體系中加入每個(gè)RNA樣品和水，以取代cDNA模版，以此排除基因組DNA污染和引物二聚體的形成。

1.8 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 13.0對(duì)酵母生長(zhǎng)速率、基因表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析，分別檢驗(yàn)轉(zhuǎn)入不同表達(dá)載體對(duì)酵母生長(zhǎng)量及相關(guān)基因表達(dá)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ri14-3-3基因的擴(kuò)增

應(yīng)用PCR技術(shù)，使用特異性引物Ri14-3-3-F/R在接種AM真菌的胡蘿卜毛根cDNA中擴(kuò)增到了AM真菌的Ri14-3-3蛋白基因全長(zhǎng)片段，基因的長(zhǎng)度為783 bp，用凝膠電泳進(jìn)行分離后，使用DNA2000標(biāo)記對(duì)比，可以清楚看到基因的目的條帶(圖2)。

圖2 Ri14-3-3基因凝膠電泳圖譜

2.2 Ri14-3-3基因酵母異源表達(dá)菌株的篩選

為確保MD-his培養(yǎng)基上篩選到的菌落含有Ri14-3-3蛋白基因，利用14-3-3蛋白的特異性引物驗(yàn)證，得到具有783 bp條帶的菌落為轉(zhuǎn)入Ri14-3-3基因的酵母菌株(圖3)。

圖3 酵母異源表達(dá)菌株中Ri14-3-3基因的凝膠電泳圖譜

2.3 蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證

經(jīng)過(guò)MD-his缺陷培養(yǎng)基篩選，選取正常生長(zhǎng)的酵母，利用載體上的c-myc標(biāo)簽進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)入pESC-HIS空載體的酵母CK(對(duì)照)，酶切后的表達(dá)載體Ri14-3-3 Q未表達(dá)14-3-3蛋白，而在轉(zhuǎn)入未酶切的目的質(zhì)粒的S.cerevisiae177 w菌株Ri14-3-3 B中，14-3-3蛋白完整表達(dá)(圖4)。

2.4 轉(zhuǎn)入Ri14-3-3的釀酒酵母生長(zhǎng)曲線

通過(guò)監(jiān)測(cè)酵母的生長(zhǎng)分析基因功能。曲線擬合分析(圖 5)結(jié)果表明：在普通培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入Ri14-3-3的酵母生長(zhǎng)速率高于轉(zhuǎn)入空載體的酵母，在34 h達(dá)到最大生長(zhǎng)量。而轉(zhuǎn)入空載體的酵母，在36 h達(dá)到最大生長(zhǎng)量。

加入PRG 6000模擬干旱脅迫情況下，轉(zhuǎn)入Ri14-3-3的酵母生長(zhǎng)速率高于轉(zhuǎn)入空載體的酵母，且在32 h達(dá)到最大生長(zhǎng)量。轉(zhuǎn)入空載體的酵母在34 h達(dá)到最大生長(zhǎng)量，且生長(zhǎng)量最低。

CK為轉(zhuǎn)入pESC-HIS空載體的釀酒酵母對(duì)照菌株；Ri14-3-3 Q為轉(zhuǎn)入酶切的pESC-HIS-Ri14-3-3表達(dá)載體的酵母菌株；Ri14-3-3 B為轉(zhuǎn)入未酶切的pESC-HIS-Ri14-3-3表達(dá)載體的酵母菌株。

CK為轉(zhuǎn)入pESC-HIS空載體的釀酒酵母對(duì)照菌株；Ri14-3-3為轉(zhuǎn)入pESC-HIS-Ri14-3-3表達(dá)載體的酵母菌株；CK-PEG為轉(zhuǎn)入PEG處理下pESC-HIS空載體的釀酒酵母對(duì)照菌株；Ri14-3-3 PEG為PEG處理下轉(zhuǎn)入pESC-HIS-Ri14-3-3表達(dá)載體的酵母菌株。曲線數(shù)據(jù)為“ 平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”，n= 5。

2.5 Ri14-3-3調(diào)節(jié)酵母基因表達(dá)

通過(guò)查詢NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，共發(fā)現(xiàn)S.cerevisiae177 w有兩個(gè)質(zhì)膜H+-ATP酶基因(PMA1、PMA2)、三個(gè)質(zhì)膜水孔蛋白基因(AQY1、AQY2、AQY3)和兩個(gè)鈣調(diào)蛋白基因(MAC1、CMP)。通過(guò)特異性引物對(duì)這些14-3-3調(diào)控基因進(jìn)行定量分析(見(jiàn)表2)，結(jié)果表明：正常水分條件下，轉(zhuǎn)入Ri14-3-3顯著上調(diào)了MAC1的表達(dá)，下調(diào)了AQY3的表達(dá)(P<0.05)。在PEG模擬干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)入Ri14-3-3顯著上調(diào)了酵母的質(zhì)膜H+-ATP酶基因(PMA1)、水孔蛋白基因(AQY1)、鈣調(diào)蛋白基因(CMP)的表達(dá)水平；但是，Ri14-3-3對(duì)酵母的AQY2影響不顯著。與未轉(zhuǎn)入載體的酵母相比，轉(zhuǎn)入Ri14-3-3基因明顯下調(diào)酵母的AQY3、MAC1的表達(dá)水平(P<0.05)。

表2 Ri14-3-3調(diào)節(jié)的釀酒酵母(Saccharomyces cerebrum)177 w中基因相對(duì)表達(dá)量

注：CK為轉(zhuǎn)入pESC-HIS空載體的釀酒酵母對(duì)照菌株；Ri14-3-3為轉(zhuǎn)入pESC-HIS-Ri14-3-3表達(dá)載體的酵母菌株；CK-PEG為轉(zhuǎn)入PEG處理下pESC-HIS空載體的釀酒酵母對(duì)照菌株；Ri14-3-3 PEG為PEG處理下轉(zhuǎn)入pESC-HIS-Ri14-3-3表達(dá)載體的酵母菌株。表中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”，n=5；數(shù)據(jù)后，同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討論

AM真菌的14-3-3蛋白基因不僅能在干旱脅迫下表達(dá)上調(diào)，還可通過(guò)調(diào)節(jié)植物信號(hào)通路和干旱響應(yīng)基因，增強(qiáng)AM真菌對(duì)植物耐旱性的調(diào)節(jié)[15]。目前，由于對(duì)AM真菌感受干旱脅迫信號(hào)通路的分子機(jī)制缺乏認(rèn)識(shí)，很難深入揭示干旱脅迫條件下AM 真菌直接調(diào)控宿主植物抗旱的分子機(jī)理。本研究從R.irregularis中克隆得到了14-3-3蛋白基因Ri14-3-3。通過(guò)測(cè)定14-3-3蛋白活性和驗(yàn)證基因功能，揭示了14-3-3蛋白對(duì)下游干旱響應(yīng)基因的調(diào)控作用。

鑒于研究AM真菌遺傳學(xué)的技術(shù)缺陷(因其無(wú)性繁殖以及1個(gè)AM真菌細(xì)胞中存在具有不同遺傳特性的多個(gè)細(xì)胞核，使得轉(zhuǎn)化系統(tǒng)不穩(wěn)定)，利用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法原位研究AM真菌基因功能受到局限[16]。本研究以釀酒酵母單倍體菌株S.cerevisiae177 w作為材料，通過(guò)異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)AM真菌的14-3-3蛋白基因Ri14-3-3對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)和抗旱能力的影響。在酵母中分別轉(zhuǎn)入空載體和帶有Ri14-3-3的表達(dá)載體Ri14-3-3-pESC-HIS，測(cè)定兩種酵母生長(zhǎng)速率的差異。試驗(yàn)結(jié)果表明：在酵母生長(zhǎng)過(guò)程中，轉(zhuǎn)入Ri14-3-3顯著提高了酵母的生長(zhǎng)速率和最大生長(zhǎng)量。Irie et al.[17]研究證明，S.cerevisiae中含有2個(gè)14-3-3蛋白基因(BMH1、BMH2)，并且這2個(gè)基因分別敲除不影響酵母的生長(zhǎng)，而2個(gè)基因全部敲除的酵母無(wú)法生長(zhǎng)。為了研究外源14-3-3基因?qū)湍干L(zhǎng)的影響，以往研究曾嘗試在釀酒酵母中轉(zhuǎn)入植物14-3-3基因GF14，GF14同樣在載體中GAL1啟動(dòng)子控制下表達(dá)。結(jié)果證實(shí)，GF14的轉(zhuǎn)入，可彌補(bǔ)酵母14-3-3蛋白基因BMH1、BMH2的缺失[18]。本研究結(jié)果與之相符，說(shuō)明Ri14-3-3基因的轉(zhuǎn)入，起到調(diào)控細(xì)胞周期的作用，促進(jìn)了酵母的生長(zhǎng)。Teunissen et al.[19]研究表明，14-3-3蛋白在酵母細(xì)胞周期后期發(fā)揮重要調(diào)控作用。14-3-3蛋白在細(xì)胞周期的特定位點(diǎn)參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和蛋白激酶的激活，調(diào)節(jié)磷脂的水解和激活胞外分泌過(guò)程[20]。在PEG處理下，Ri14-3-3基因顯著提高了酵母的生長(zhǎng)速率，并且使酵母具有更高的生長(zhǎng)量，而轉(zhuǎn)入空載體的酵母生長(zhǎng)速率降低，表明在干旱脅迫下Ri14-3-3可調(diào)節(jié)酵母的細(xì)胞周期，維持酵母的生長(zhǎng)發(fā)育和保持水分，增強(qiáng)酵母抵抗干旱脅迫的能力。

14-3-3蛋白基因可調(diào)控多種脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，參與生物抵抗干旱脅迫的生理過(guò)程[21]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證AM真菌Ri14-3-3蛋白基因?qū)湍干L(zhǎng)以及脅迫響應(yīng)基因的調(diào)節(jié)，本研究分別在正常培養(yǎng)基和PEG模擬干旱脅迫的培養(yǎng)基中培養(yǎng)酵母，并對(duì)14-3-3下游基因的表達(dá)進(jìn)行了熒光定量PCR測(cè)定。結(jié)果表明，在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)入AM真菌的Ri14-3-3顯著上調(diào)酵母的質(zhì)膜H+-ATP酶基因(PMA1)的表達(dá)。14-3-3蛋白與質(zhì)膜H+-ATP酶結(jié)合形成復(fù)合體，上調(diào)質(zhì)子泵的活性，促進(jìn)H+外流，可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。在滲透脅迫下，百合(Liliumbrownii)的根系細(xì)胞中14-3-3蛋白的累積，使質(zhì)膜H+-ATP酶活性明顯提高，使細(xì)胞質(zhì)子外流，從而導(dǎo)致細(xì)胞外滲透勢(shì)提高[22]。細(xì)胞液堿化可激活脅迫信號(hào)的傳遞通路，誘導(dǎo)細(xì)胞改變離子通道蛋白的活性以改變細(xì)胞的滲透勢(shì)。當(dāng)懸浮培養(yǎng)的甜菜細(xì)胞和原生質(zhì)體受到滲透脅迫時(shí)，質(zhì)子外流成倍增加，膜上14-3-3蛋白含量增加2～3倍，表明14-3-3蛋白參與滲透脅迫調(diào)節(jié)[23]。質(zhì)膜H+-ATP酶活性在為細(xì)胞的離子轉(zhuǎn)運(yùn)提供動(dòng)力這一基本生命活動(dòng)中起到重要作用，14-3-3蛋白通過(guò)對(duì)質(zhì)膜H+-ATP酶活性調(diào)節(jié)，對(duì)細(xì)胞維持滲透起到調(diào)控功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，Ri14-3-3顯著上調(diào)酵母水孔蛋白基因(AQY1)、鈣調(diào)蛋白基因(CMP)的表達(dá)。研究表明，14-3-3蛋白主要通過(guò)調(diào)控蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子參與對(duì)植物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控。在擬南芥中，CDPK與14-3-3蛋白偶聯(lián)，其Ca2+活性可提高近兩倍[24]。Ca2+是重要的第二信使，在細(xì)胞中脅迫信號(hào)的傳導(dǎo)過(guò)程中起到重要作用，在不同干旱脅迫情況均可檢測(cè)到胞內(nèi)Ca2+濃度的瞬時(shí)增加。14-3-3激活了直接參與吸水的CDPK，引起胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。Azad et al.[25]指出，質(zhì)膜水通道蛋白可通過(guò)CDPK磷酸化，并通過(guò)2A型蛋白磷酸酶去磷酸化，14-3-3蛋白在這一過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。干旱脅迫下，AM真菌的Ri14-3-3蛋白基因通過(guò)上調(diào)鈣調(diào)蛋白基因(CMP)，激活質(zhì)膜水孔蛋白基因(AQY1)的表達(dá)，可促進(jìn)酵母對(duì)水分的吸收，使酵母在脅迫環(huán)境中維持生長(zhǎng)發(fā)育。本研究表明，AM真菌可通過(guò)調(diào)控Ri14-3-3蛋白基因的表達(dá)促進(jìn)水分的吸收和運(yùn)輸，增強(qiáng)植物對(duì)干旱脅迫的耐受性。

4 結(jié)論

為證明AM真菌14-3-3蛋白基因在提高植物抗旱性方面的直接貢獻(xiàn)，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物，克隆了AM真菌R.irregularis中Ri14-3-3基因的全長(zhǎng)片段。釀酒酵母異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)證明，無(wú)論正常條件，還是干旱脅迫下，Ri14-3-3均可提高酵母的生長(zhǎng)速率和生長(zhǎng)量。AM真菌14-3-3蛋白不僅促進(jìn)酵母生長(zhǎng)，還能上調(diào)酵母質(zhì)膜H+-ATP酶基因(PMA1)、鈣調(diào)蛋白基因(CMP)和水孔蛋白基因(AQY1)的表達(dá)，說(shuō)明AM真菌14-3-3蛋白可調(diào)控干旱脅迫響應(yīng)基因，調(diào)節(jié)干旱脅迫下真菌的水分狀況，提高抗旱性。Ri14-3-3在植物耐受干旱過(guò)程中起到多重調(diào)控作用，在后續(xù)的研究中應(yīng)結(jié)合盆栽試驗(yàn)，在干旱脅迫下驗(yàn)證Ri14-3-3對(duì)植物水分生理的調(diào)控作用。