白樺BpTOPP1基因功能1)

陳繼英 劉超逸 王朔 徐文娣 黃海嬌 姜靜

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

歐洲白樺(Betulapendula)廣泛分布于歐亞大陸和北美，其種內(nèi)變種裂葉樺(B.pendula‘Dalecarlica’)葉片邊緣呈掌狀深裂，具有極高的觀賞價值[1]，是人們喜愛的園林綠化樹種之一[2-3]。近年來，人們通過對擬南芥(Arabidopsisthaliana)、苜蓿(Medicagotruncatula)、白菜(Brassicarapassp.chinensis)等研究，對植物葉緣缺刻變異的遺傳機(jī)理逐漸明晰起來，認(rèn)為葉緣缺刻的形成與生長素的極性運(yùn)輸產(chǎn)生濃度梯度密切相關(guān)[4-10]。有研究證明在植物生長素信號通路中通過可逆磷酸化作用調(diào)節(jié)生長素運(yùn)輸，其中,PPP家族絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用[11-12]。蛋白激酶和蛋白磷酸酶介導(dǎo)蛋白質(zhì)的可逆磷酸化是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要機(jī)制之一，是生物體內(nèi)普遍存在的調(diào)控細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的重要作用方式，根據(jù)以前的研究表明,蛋白磷酸酶參與了ABA、病原侵染、脅迫及發(fā)育信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[13]。

研究團(tuán)隊為了挖掘控制葉緣缺刻性狀的關(guān)鍵基因，以裂葉樺不同發(fā)育時期葉脈組織為材料，構(gòu)建了基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，TOPP1(TypeOneProteinPhosphatase1)就是第一層網(wǎng)絡(luò)中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一。根據(jù)底物的特異性差異和對特定抑制劑的反應(yīng)不同，絲氨酸和蘇氨酸蛋白磷酸酶可分為1型(PP1)和2型(PP2)[14]，1型絲氨酸與蘇氨酸蛋白磷酸酶(PP1s)與植物生長和發(fā)育的各種過程有關(guān)，在所有的植物物種中，PP1s由多基因家族編碼[15]。PP1s是一大組絲氨酸和蘇氨酸蛋白磷酸酶，在擬南芥中，PP1s被稱為1型蛋白磷酸酶(TOPPs)，先前的研究確認(rèn)了8個擬南芥的PP1s基因(TOPP1-TOPP8)[15]。以往的研究表明，它們調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和藍(lán)光依賴的氣孔開放。水稻(Oryzasativa)中PP1基因的過表達(dá)可以增強(qiáng)植物的耐鹽性[16]。擬南芥中研究表明，TOPP1是ABA信號通路的一個新的組件，TOPP1基因與它的調(diào)節(jié)蛋白AtI-2(ArabidopsisInhibitor-2)負(fù)調(diào)控ABA信號[17]。然而TOPP1基因在調(diào)節(jié)木本植物生長和發(fā)育的分子機(jī)制的研究尚不明確。

為了研究白樺(B.platyphylla×B.pendula)BpTOPP1基因的功能，實(shí)驗采用qRT-PCR方法進(jìn)行BpTOPP1的時空表達(dá)特性分析，同時以白樺的cDNA為模板克隆BpTOPP1基因并構(gòu)建35S啟動子驅(qū)動的過表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)合子胚的方法進(jìn)行白樺的遺傳轉(zhuǎn)化。擬探討B(tài)pTOPP1基因在白樺葉發(fā)育過程中的作用。

1 材料與方法

基因定量分析所需的材料取自東北林業(yè)大學(xué)白樺育種基地3年生歐洲白樺(對照)和裂葉樺無性系的不同個體，取材部位是歐洲白樺和裂葉樺的第1～4片葉片(L1～L4)，取材時間為5月至9月初，每隔15 d取一次材料，其中6月21日是按組織部位取材，分別采集2個無性系不同單株的頂芽(B)、第1～4片葉片(L1～L4)、嫩莖(S1～S3)、木質(zhì)部(X)、根(R)、葉脈(P1～P4)、葉柄(V1～V4)等，材料采集后每個無性系相同組織部位混樣后分3～4份包裝并迅速放入液氮中，帶回實(shí)驗室置于超低溫冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

基因克隆材料取自白樺組培苗葉片,白樺遺傳轉(zhuǎn)化受體為本實(shí)驗室保存的白樺優(yōu)樹成熟種子。

1.1 BpTOPP1基因的生物信息學(xué)分析與預(yù)測

利用ExPASy網(wǎng)站(http://web.expasy.org/protparam/)對BpTOPP1基因進(jìn)行氨基酸的理化性質(zhì)分析，登陸NCBI網(wǎng)頁，用BlastP程序?qū)pTOPP1基因的氨基酸序列進(jìn)行比對、構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2 BpTOPP1的qRT-PCR

利用Primer 5.0軟件設(shè)計白樺BpTOPP1基因及內(nèi)參引物，并利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序進(jìn)行基因序列的比對，進(jìn)而保證引物特異性(表1)，所用引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 qRT-PCR引物序列

采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司的植物總RNA提取試劑盒將所取的試驗材料提取總RNA，并用ReverTre Ace? qPCR RT Kit(Toyobo，Ltd，Osaka，Japan)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,將cDNA稀釋10倍后用作qRT-PCR的模板[18],以18S rRNA作為內(nèi)參擴(kuò)增BpTOPP1基因。反應(yīng)體系為：2×SBYR Green PCR Master Mix 10 μL,PCR Forward Primer(10 μL/L)1 μL,PCR Reverse Primer(10 μL/L)1 μL,模板(cDNA溶液)2 μL,加入ddH2O補(bǔ)足到20 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 3 min預(yù)變性,然后以95 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s、57 ℃ 40 s進(jìn)行40個循環(huán)，最后95 ℃ 1 min、55 ℃ 30 s、95 ℃ 30 s,進(jìn)行溶解曲線分析。在ABI 7500定量PCR儀上完成qRT-PCR，3次重復(fù)，用2-ΔΔCt的方法對定量結(jié)果進(jìn)行分析[19-24]。

1.3 BpTOPP1基因的遺傳轉(zhuǎn)化

BpTOPP1基因通過雙酶切的方法進(jìn)行載體構(gòu)建(圖1)，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)合子胚法進(jìn)行BpTOPP1基因的遺傳轉(zhuǎn)化，將切好的白樺無菌合子胚置于DO600=0.5左右的工程菌液中侵染3～5 min，置于暗處進(jìn)行共培養(yǎng)(WPM+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA)2～3 d，隨后進(jìn)行選擇培養(yǎng)(WPM+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+50 mg/L潮霉素+200 mg/L頭孢霉素)，2～3周后陸續(xù)產(chǎn)生抗性愈傷組織，20 d后將抗性愈傷轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)(WPM+0.8～1.0 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3+50 mg/L潮霉素+200 mg/L頭孢霉素)，待其長出不定芽后進(jìn)行繼代培養(yǎng)(WPM+0.8L～1.0 mg/L 6-BA+50 mg/L潮霉素+200 mg/L頭孢霉素)[25-26]，20～30 d后不定芽生長至3～5 cm時，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(WPM+0.2 mg/L IBA)中，獲得白樺潮霉素抗性株系。

圖1 植物表達(dá)載體示意圖

1.4 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測

利用BioTeke新型快捷植物基因組DNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)基因白樺和WT葉片的DNA。以各株系DNA為模版，以BpTOPP1-F1(5’-GGGGTACCATGGAACCTGCAGTCCTGGA-3’)、BpTOPP1-R1(5’-GCTCTAGAATCACTAGGCTTAGCTGCAGCTG-3’)為引物，進(jìn)行PCR鑒定。以各株系葉片cDNA為模板，以BpTOPP1-F、BpTOPP1-R為引物，以18 S為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR，3次重復(fù)。通過2-ΔΔCT法計算BpTOPP1基因在各株系中的相對表達(dá)量。

1.5 生長性狀的調(diào)查

采用組培技術(shù)擴(kuò)大繁殖獲得的轉(zhuǎn)基因及對照白樺，2017年5月中旬將組培生根苗移栽至育苗盤中，每個株系移栽50株，在同年9月中旬時進(jìn)行葉綠素調(diào)查，用手持型葉綠素儀(SPAD502，Japan)測定轉(zhuǎn)基因株系和對照株系的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，選取功能葉進(jìn)行測定，每個株系測10株，每株測3次重復(fù)。在9月末植物停止生長后，每個株系分別選擇10株生長一致的苗木，取第4片功能葉進(jìn)行葉面積、葉寬和葉長的調(diào)查，并對這10株苗木進(jìn)行苗高和地徑調(diào)查。

2 結(jié)果與分析

2.1 BpTOPP1基因的生物信息學(xué)

利用ExPASy網(wǎng)站(http://web.expasy.org/protparam/)對BpTOPP1基因以及其家族基因進(jìn)行氨基酸的理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明BpTOPP1轉(zhuǎn)錄因子基因編碼氨基酸為313個，分子式為C1603H2487N427O461S20，分子質(zhì)量為35 758.16 u，原子總數(shù)為4 998。通過白樺轉(zhuǎn)錄組測序得到BpTOPP1基因的全長序列，用NCBI上的ORF finder對該序列進(jìn)行分析，該基因包含1個942 bp的開放閱讀框，終止密碼子為UGA，該基因包含4個外顯子和3個內(nèi)含子。通過NCBI找出擬南芥(Arabidopsisthaliana)的PP1s氨基酸序列，與白樺的BpTOPP1的全長氨基酸序列繪制進(jìn)化樹(圖2)，結(jié)果顯示：白樺BpTOPP1與擬南AtTOPP6和AtTOPP4氨基酸序列同源性最高。

圖2 BpTOPP1進(jìn)化樹分析

2.2 BpTOPP1基因在野生型歐洲白樺和裂葉樺中的表達(dá)模式

為了更好的了解BpTOPP1基因在白樺生長發(fā)育過程中的作用，試驗分析了BpTOPP1基因在歐洲白樺和裂葉樺中的表達(dá)模式。不同組織器官qRT-PCR結(jié)果顯示，在歐洲白樺中，只有L2葉片的BpTOPP1基因呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，其表達(dá)量是對照的2.03倍；該基因在其他組織部位中均呈現(xiàn)顯著下調(diào)表達(dá)(P<0.05,F=1 307)，其表達(dá)量的平均值低于對照的84.13%(圖3)。在裂葉樺中，該基因在第3幼莖及L1～L4葉柄呈上調(diào)表達(dá)，其表達(dá)量平均值是對照的1.83倍，在V2葉脈中該基因的表達(dá)量無明顯差異；而在其他組織部位均呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，其表達(dá)量的平均值低于對照的62.88%(圖3)。通過測定BpTOPP1基因在兩種樺樹中的表達(dá)量，推測該基因與白樺葉片的生長發(fā)育相關(guān)。

植物組織部位

為了能更進(jìn)一步了解BpTOPP1基因在白樺的生長發(fā)育過程中的作用，試驗又分析了不同時期BpTOPP1基因在裂葉樺和歐洲白樺葉片中的表達(dá)，結(jié)果見圖4。若以5月5日兩種樺樹的第4片葉為對照，測定BpTOPP1基因的表達(dá)量，qRT-PCR結(jié)果顯示，在不同的時期，BpTOPP1基因在兩種樺樹中均表達(dá)，在5月5和8月22日時，裂葉樺中該基因的表達(dá)量顯著高于歐洲白樺，分別是歐洲白樺的4.24和11.1倍，而在7月21日時，該基因的表達(dá)量在歐洲白樺中顯著高于裂葉樺，是裂葉樺的10.72倍。

日期

2.3 35S::BpTOPP1轉(zhuǎn)基因白樺的獲得

采用雙酶切的方法構(gòu)建了BpTOPP1過表達(dá)載體，以野生型白樺的cDNA為模板，分別用KpnI和XbaI對BpTOPP1基因及1300質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，將酶切純化后的BpTOPP1與載體質(zhì)粒1300進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒，命名為35S::BpTOPP1。

BpTOPP1基因的遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)合子胚的方法，將選取的種子在自來水下沖洗2～3 d，待種子充分吸水飽滿后，即將露出芽點(diǎn)時，在超凈工作臺中對種子進(jìn)行表面消毒。在無菌培養(yǎng)皿中縱切合子胚，去掉種皮，將切好的合子胚置于已經(jīng)活化好的含有35S::BpTOPP1的工程菌液中，侵染白樺合子胚后共培養(yǎng)，然后進(jìn)行選擇培養(yǎng)。20 d后將獲得的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，10～15 d長出抗性不定芽后轉(zhuǎn)至繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)，30 d后長出潮霉素抗性叢生苗，10～15 d可以獲得生根苗，將生根苗移栽至育苗盤中，獲得35S::BpTOPP1轉(zhuǎn)基因白樺6個株系，命名為TO-1…TO-6(圖5)。

2.4 35S::BpTOPP1轉(zhuǎn)基因白樺的分子檢測

試驗獲得6個35S::BpTOPP1遺傳轉(zhuǎn)化子，分別提取潮霉素抗性株系的1年生苗木的總DNA，以中間載體質(zhì)粒1300為陽性對照，WT為陰性對照，同時設(shè)水對照，對潮霉素抗性植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(圖6)。結(jié)果顯示，6個35S::BpTOPP1潮霉素抗性株系均在在942 bp處擴(kuò)增出了單一條帶，而WT株系沒有擴(kuò)增出條帶(圖6)，因此可以初步判斷，外源目的基因已經(jīng)整合到白樺基因組中。

1.DNA Marker DL2000；2.陽性對照；3.陰性對照；4.水對照；泳道5～10為35S::BpTOPP1轉(zhuǎn)基因的白樺。

為了檢測外源基因在轉(zhuǎn)基因白樺體內(nèi)的穩(wěn)定性遺傳，對1年生的轉(zhuǎn)基因白樺進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示(表2)，35S::BpTOPP1轉(zhuǎn)基因白樺中BpTOPP1基因的相對表達(dá)量均顯著高于WT(P<0.05,F=17 970)，6個株系中該基因的平均表達(dá)量是WT的8.12倍,其中TO-6株系中BpTOPP1基因的相對表達(dá)量最高，表達(dá)量是WT的18.75倍，可以進(jìn)一步說明外源BpTOPP1基因在轉(zhuǎn)基因白樺組織細(xì)胞中能夠過量表達(dá)。

表2 轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ瞻讟逯蠦pTOPP1基因的表達(dá)特性

注：表中數(shù)據(jù)是平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)后同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 35S::BpTOPP1轉(zhuǎn)基因白樺的表型特征

對35S::BpTOPP1轉(zhuǎn)基因白樺進(jìn)行表型觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6個轉(zhuǎn)基因白樺株系葉片延遲脫落(圖7A)，對相同時期的第1片葉進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株的第1片葉正處于生長期(圖7C、D)，而WT植株的第1片葉已經(jīng)發(fā)育成成熟葉片，葉片表面革質(zhì)化(圖7B)；掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系葉脈上分布較多表皮毛(圖7D、F)，而WT株系葉脈上則少見表皮毛(圖7E)。

A.轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩晗档娜~片脫落情況；B.非轉(zhuǎn)基因?qū)φ瞻讟宓牡谝黄~；C、D.轉(zhuǎn)基因白樺的第一片葉；E.非轉(zhuǎn)基因?qū)φ瞻讟迦~脈的表皮毛；F、G.轉(zhuǎn)基因白樺葉脈的表皮毛。

2.6 35S::BpTOPP1轉(zhuǎn)基因植株生長形狀

獲得的6個1年生的35S::BpTOPP1轉(zhuǎn)基因株系，可以觀察到轉(zhuǎn)基因株系的葉片變小(表3)，轉(zhuǎn)基因植株與WT株系差異明顯,葉面積平均值為21.32，低于WT葉面積的42.2%(P<0.05，F(xiàn)=298.531)，對轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行葉片長度和寬度調(diào)查，轉(zhuǎn)基因株系的葉片長度和寬度也顯著低于WT，其葉片長度的平均值是5.74 cm，低于WT葉片長度的30.42%(P<0.05，F(xiàn)=1 519),其葉片寬度的平均值是4.41 cm，低于WT葉片寬度32.31%(P<0.05，F(xiàn)=837.846)(表3)。

表3 1年生BpTOPP1轉(zhuǎn)基因白樺的葉面積及葉片長寬

注：表中數(shù)據(jù)是平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)后同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

轉(zhuǎn)基因白樺苗高、地徑及葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較，對1年生的6個35S::BpTOPP1轉(zhuǎn)基因白樺進(jìn)行苗高和地徑的方差分析，結(jié)果顯示，2個性狀在株系間的差異均達(dá)到了顯著水平,在苗高生長方面，6個轉(zhuǎn)基因株系均顯著低于WT株系，其平均苗高為WT的80.28%，其中轉(zhuǎn)基因株系TO-2的苗高最矮，僅為WT的57.41%(P<0.05，F(xiàn)=118.902)；在地徑生長方面，除TO-1株系外，其他5個轉(zhuǎn)基因株系地徑均顯著高于WT株系，其中TO-5株系地徑高于WT的12.16%(P<0.05，F(xiàn)=53.424)；葉綠素相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)調(diào)查顯示，轉(zhuǎn)基因株系TO-2、TO-4、TO-5和TO-6等4個轉(zhuǎn)基因株系顯著高于WT株系(P<0.05，F(xiàn)=34.319)，其均值高于WT的1.05倍，TO-1、TO-3轉(zhuǎn)基因株系與WT株系差異不明顯(表4)。

表4 1年生BpTOPP1轉(zhuǎn)基因白樺的苗高地徑及葉綠素比較

注：表中數(shù)據(jù)是平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)后同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

葉片是植物體營養(yǎng)器官中對環(huán)境變化最為敏感的器官，是植物進(jìn)行光合作用和蒸騰作用的主要器官[27-29]。其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理特性易受水分、溫度、光照等環(huán)境因素的影響，不同環(huán)境條件下植物的葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)差異很大,如:強(qiáng)光生境下，植物葉片小而厚、葉片內(nèi)部柵欄組織發(fā)達(dá)；弱光條件下，葉片形態(tài)大而薄、比葉質(zhì)量??；高溫環(huán)境下，植物體現(xiàn)出葉片較厚、氣孔密度大、比葉面積增加等適應(yīng)特征[30-31]。本研究克隆的BpTOPP1基因，該基因在木本植物中研究較少，在擬南芥研究證明，TOPPS基因參與植物的生長和發(fā)育的各個過程，主要在根、蓮座葉和花中表達(dá)[15]，擬南芥TOPP4基因在幼苗中是高表達(dá)的，而且該基因在葉片中形成表皮扁平細(xì)胞相互交錯起到關(guān)鍵作用，通過抑制TOPP4基因的表達(dá)量會出現(xiàn)矮化的表型[32-33]。本研究發(fā)現(xiàn)，在相同條件下過表達(dá)株系中BpTOPP1基因的表達(dá)量較非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼忻黠@的提高；過表達(dá)株系的葉片面積、葉長和葉寬均顯著小于野生型對照；因此，認(rèn)為該基因?qū)τ诎讟迦~片的生長發(fā)育起到重要的作用。對獲得轉(zhuǎn)基因白樺的生長性狀進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其高生長比較緩慢，顯著低于野生型對照植株，BpTOPP1基因在參與葉發(fā)育調(diào)控的同時是否也參與調(diào)控植物的高生長，其調(diào)控途徑如何，這些還需深入研究。

歐洲白樺和裂葉樺的時空表達(dá)分析表明：在分部位表達(dá)中，BpTOPP1基因在歐洲白樺L2葉中的表達(dá)量顯著高于其他組織，其表達(dá)量高于對照的103.36%，在裂葉樺中該基因主要在葉脈中呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，其平均值為對照的1.97倍；在時序表達(dá)中，7月21日時BpTOPP1基因在歐洲白樺中的表達(dá)量達(dá)到峰值，在5月5日和8月22日時該基因在裂葉樺中的表達(dá)量較高。根據(jù)該基因在兩種樺樹時空表達(dá)分析推測該基因與葉發(fā)育相關(guān)。

目前，在植物中已確定了多種蛋白激酶和蛋白磷酸酶，其中蛋白磷酸酶和蛋白激酶一樣能對生物體內(nèi)的有關(guān)代謝起重要的調(diào)節(jié)作用[34]。在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的新的組成部分，即1型蛋白磷酸酶1(TOPP1)及其調(diào)控蛋白AtI-2，它們在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起負(fù)調(diào)控作用，而這種抑制可通過AtI-2加強(qiáng)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著植物停止生長，轉(zhuǎn)基因白樺出現(xiàn)葉片延遲脫落的現(xiàn)象，因此推測BpTOPP1基因在在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起作用。

本研究主要對BpTOPP1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因白樺及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ者M(jìn)行表型分析，探討B(tài)pTOPP1基因與白樺生長發(fā)育的關(guān)系，為揭示該基因在白樺生長和葉發(fā)育中行使的功能提供參考。當(dāng)然，植物的葉發(fā)育過程中涉及到多條基因的調(diào)控，基因間的關(guān)系也極其復(fù)雜，因此我們團(tuán)隊將繼續(xù)探討B(tài)pTOPP1基因在葉片的生長發(fā)育過程中的作用，進(jìn)一步闡明BpTOPP1基因的功能。