桑葚中烯酰嗎啉殘留量測定

李國烈

（南充農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗(yàn)中心，四川南充 637000）

烯酰嗎啉（dimethomorph），化學(xué)名稱為4-[3-(4-氯苯基)-3-(3,4-二甲氧基苯基)丙烯酰]嗎啉，存在2種異構(gòu)體（Z、E型）。其為高效卵菌綱真菌殺菌劑，具有內(nèi)吸、治療和抗孢子形成等特性，對卵菌生命周期的各個階段都有效[1]。烯酰嗎啉影響病原菌細(xì)胞壁分子結(jié)構(gòu)的重排，干擾細(xì)胞壁聚合體的組裝，進(jìn)而干擾細(xì)胞壁的形成。其可用于防治多種作物上由霜霉屬和疫霉屬病菌引發(fā)的病害，且與甲霜靈、苯霜靈等苯基酰胺類殺菌劑無交互抗性[2-3]。烯酰嗎啉廣泛用于蔬菜和水果，因此，其殘留具有較高的檢出率[4]。報(bào)道的烯酰嗎啉殘留檢測分析方法主要有氣相色譜法[5-6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-8]、液相色譜法[9]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-11]，檢測基質(zhì)包括葡萄[7-8]、草莓[6]、龍眼[12]、柑橘[13]、檸檬[7]、黃瓜[9,14-15]、大蒜[16]、辣椒[13]、煙草[11]、大豆[17]、番茄[18]、甘藍(lán)[3]、白菜[19-20]、萵筍[21]、油麥菜[21]、胡椒[5]、大蔥[22]、生姜[18]、胡蘿卜[18]、菠菜[18]、白木耳[18]、洋蔥[7]、三七[23]和人參[24]等。

桑葚（mulberry）含有豐富的糖分、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)以及桑色素、桑素、黃酮類化合物等活性物質(zhì)，具有豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值[25]。我國將其列為“既是食品又是藥品”的農(nóng)產(chǎn)品[26]。桑葚病蟲害的防治通常以化學(xué)防治為主[27]。在實(shí)際生產(chǎn)中，由于用藥不當(dāng)易造成桑葚中化學(xué)農(nóng)藥殘留污染，危害人類健康和產(chǎn)業(yè)發(fā)展。李國烈等[28-30]報(bào)道了桑葚中醚菌酯、噻蟲嗪、吡蟲啉和啶蟲脒的殘留檢測。覃明麗等[31]和趙鑫等[32]報(bào)道了桑葚中樂果、甲基硫菌靈和腐霉利的殘留分析方法，但尚未見關(guān)于烯酰嗎啉在桑葚中的殘留分析報(bào)道。本試驗(yàn)建立了桑葚中烯酰嗎啉殘留檢測的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法（UPLC-MS/MS），并研究了在該試驗(yàn)條件下烯酰嗎啉在桑葚中的基質(zhì)效應(yīng)，以期為桑葚中烯酰嗎啉的殘留分析檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品和試劑

烯酰嗎啉標(biāo)準(zhǔn)品購于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所（標(biāo)準(zhǔn)品編號為SB05-140-2008）；甲醇、乙腈、甲苯、甲酸等試劑均為質(zhì)譜級，購于Fisher公司。

1.2 儀器和設(shè)備

Acquity UPLC/Xevo TQ-S超高效液相色譜-質(zhì)譜儀、Xbridge C18色譜柱（50 mm×3.0 mm，3.5 μm），Waters公司；FP3010勻漿機(jī)，德國Braun公司；ML802分析天平，梅特勒-托利多公司；固相萃取裝置、Mega BE Carbon/NH2固相萃取小柱 （500 mg，6 mL），Agilent公司；50 mL離心管，Eppendorf中國有限公司；HS501搖床、Vortex Genius 3旋渦混合器，IKA集團(tuán)；N-EVAP112氮吹儀，美國Organomation公司；3-18KS離心機(jī)，Sigma公司；Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司；微孔濾膜（PTFE 0.22 μm），天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 樣品處理

1.3.1 提取

準(zhǔn)確稱取勻漿后的桑葚樣品10.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈提取，置于搖床以300 r/min速率振搖30 min，再加入5 g氯化鈉，蓋上塞子，劇烈振蕩1 min，然后置于離心機(jī)中以10 000 r/min速率離心10 min，移取上清液于50mL離心管中，待凈化。

1.3.2 凈化

Mega BE Carbon/NH2固相萃取小柱先用5 mL乙腈＋甲苯（體積比為3∶1）活化。移取10 mL上述待凈化液過柱，收集濾液，再用25 mL乙腈＋甲苯（體積比為3∶1）分5次洗脫，合并洗脫液，于40℃氮吹至近干。用5.00 mL 50%甲醇水溶液定容，旋渦混合器混勻后過0.22 μm濾膜，待檢測。

1.4 儀器條件

流動相采用0.1%甲酸甲醇溶液＋0.1%甲酸水溶液＋0.1%甲酸乙腈溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序見表1。流動相使用前用超聲波脫氣。柱溫35℃，樣品室溫度16℃，進(jìn)樣體積1 μL。質(zhì)譜采用電噴霧離子源正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測方式進(jìn)行采集。脫溶劑氣和錐孔氣均為高純氮?dú)猓髁糠謩e為1 000 L/h和150 L/h，碰撞氣為高純氬氣，流量為0.10 mL/min，脫溶劑溫度為500℃。定量離子對、定性離子對、毛細(xì)管電壓、錐孔電壓和碰撞電壓等相關(guān)參數(shù)見表2。

表1 測定桑葚中烯酰嗎啉殘留量的液相色譜條件

表2 質(zhì)譜參數(shù)

1.5 方法標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限

用空白基質(zhì)溶液配制質(zhì)量濃度為1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/L的烯酰嗎啉基質(zhì)標(biāo)樣溶液，采用1.4儀器條件進(jìn)行分析。以烯酰嗎啉定量離子的峰面積（Z、E型峰面積之和）為縱坐標(biāo)，基質(zhì)標(biāo)樣溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用Masslynx V4.1軟件進(jìn)行線性回歸分析，并求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。檢測限采用在最低濃度附近添加一系列已知濃度的雙平行樣品進(jìn)行測定，采用Masslynx V4.1軟件計(jì)算烯酰嗎啉的信噪比（S/N），以S/N≥3時的樣品添加濃度為方法檢測限[33]。

1.6 方法回收率和精密度

回收率試驗(yàn)采用加標(biāo)回收試驗(yàn)法。取桑葚空白樣品，按照添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00、10.00、50.00 μg/kg加入相應(yīng)的烯酰嗎啉標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度水平設(shè)6個平行樣品。所有樣品按1.3中方法進(jìn)行樣品前處理，采用1.4儀器條件測定質(zhì)量濃度，根據(jù)隨行測定的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的實(shí)測濃度?；厥章?%=樣品實(shí)測濃度/樣品理論濃度×100。精密度試驗(yàn)采用加入法，參照回收率試驗(yàn)方法，所有樣品連續(xù)測定3 d，根據(jù)隨行測定的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的實(shí)測濃度，采用Microsoft Excel 2010軟件計(jì)算該方法的日內(nèi)和日間精密度。

1.7 方法基質(zhì)效應(yīng)

參照Matuszewski等[34]提出的方法，基質(zhì)效應(yīng)采用比較不同條件下峰面積平均值的方法來評價。在純試劑標(biāo)樣溶液（A）、桑葚空白基質(zhì)標(biāo)樣溶液（B）2個條件下，分別采用3個質(zhì)量濃度（基質(zhì)濃度）1.00、10.00和50.00 μg/L來評價該方法條件下烯酰嗎啉在桑葚樣品中的基質(zhì)效應(yīng)，每個條件下重復(fù)測定5個樣品，基質(zhì)效應(yīng)為B信號峰面積/A信號峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法選擇性

該試驗(yàn)條件下，烯酰嗎啉采用反相液相色譜分離，流動相中加入體積分?jǐn)?shù)為0.10%甲酸來提高離子化效率。結(jié)果表明，桑葚基質(zhì)對桑葚樣品中烯酰嗎啉的測定干擾小，且可獲得較強(qiáng)的分子離子峰，Z、E型保留時間分別為5.08 min和5.18 min。桑葚空白樣品圖譜、烯酰嗎啉試劑標(biāo)樣溶液圖譜、烯酰嗎啉桑葚基質(zhì)標(biāo)樣溶液圖譜以及烯酰嗎啉加標(biāo)樣品圖譜分別見圖1～圖4。各圖中上圖為定量離子色譜圖，下圖為定性離子色譜圖。

圖1 桑葚空白樣品圖譜

圖2 烯酰嗎啉試劑標(biāo)樣溶液圖譜（1.00 μg/L）

圖3 烯酰嗎啉桑葚基質(zhì)標(biāo)樣溶液圖譜（1.00 μg/L）

圖4 烯酰嗎啉加標(biāo)樣品圖譜（1.00 μg/kg）

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限

該試驗(yàn)條件下，烯酰嗎啉在質(zhì)量濃度1.00～50.00 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=1.932 69×105x＋34 081.9，R2=0.999。以3倍基線噪聲的藥物濃度為檢測限，烯酰嗎啉在桑葚中的檢測限為0.25 μg/kg。以4倍方法檢測限為定量限，則桑葚中烯酰嗎啉的定量限為1.00 μg/kg。

2.3 方法回收率和精密度

該試驗(yàn)條件下，烯酰嗎啉在1.00、10.00和50.00 μg/kg 3個添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的平均回收率分別為92.18%、95.11%、104.39%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為4.48%、4.31%和1.56%（見表3）。結(jié)果表明，該試驗(yàn)方法在測定桑葚中烯酰嗎啉殘留量時具有較高的回收率。方法的日內(nèi)精密度RSD分別為4.85%、4.28%、3.48%，日間精密度RSD分別為5.13%、4.60%、4.27%（見表4）。結(jié)果表明，該試驗(yàn)方法具有很好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

表3 方法的回收率（n=6）測定結(jié)果

表4 方法日內(nèi)精密度和日間精密度（n=6）測定結(jié)果

2.4 方法基質(zhì)效應(yīng)

采用Matuszewski等[34]提出的方法來評價烯酰嗎啉在桑葚樣品中的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表5。在1.00、10.00和50.00 μg/L 3個質(zhì)量濃度水平下，烯酰嗎啉在桑葚樣品中的基質(zhì)效應(yīng)分別為93.51%、84.81%和87.51%，RSD分別為2.35%、1.12%和0.64%。由結(jié)果可知，在質(zhì)量濃度為1.00～50.00 μg/L范圍內(nèi)，烯酰嗎啉在桑葚樣品中的基質(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，并且隨著濃度的變化而變化。因此，在測定桑葚中烯酰嗎啉殘留量時，為避免因使用純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正引起的分析結(jié)果偏差，應(yīng)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液或工作曲線的方法進(jìn)行校正。

表5 桑葚中烯酰嗎啉殘留量測定的基質(zhì)效應(yīng)（n=5）

3 結(jié)論

該試驗(yàn)采用乙腈提取桑葚樣品，石墨化炭黑/氨基復(fù)合柱凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）測定其中烯酰嗎啉殘留量（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正）。該方法前處理操作簡便，方法的選擇性、檢測限、回收率、精密度和標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍及其相關(guān)系數(shù)均滿足樣品分析要求，適用于桑葚中烯酰嗎啉殘留量的測定。