烯肟菌酯原藥對大鼠急性吸入毒性的測定

吳宗澄

（沈陽化工研究院有限公司 安全評價中心，沈陽 110021）

烯肟菌酯是沈陽化工研究院自主研制的新型殺菌劑，屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑。其化學名稱為2-[[[3-(4-氯苯基)-1-甲基-2-烯丙基-1-亞氨基]氧基]甲基]-α-(甲氧基亞甲基)苯乙酸甲酯[1]。烯肟菌酯殺菌譜廣、活性高，具有預(yù)防及治療作用，對由鞭毛菌引起的多種植物病害有良好的防治效果。其與氟嗎啉和霜脲氰無交互抗性，且與環(huán)境有良好的相容性，符合高效、低毒，環(huán)境友好的新農(nóng)藥發(fā)展方向[1-2]。烯肟菌酯原藥目前報道的毒性有：大鼠急性經(jīng)口LD50值為1 470 mg/kg（雄性）、1 080 mg/kg（雌性）；大鼠急性經(jīng)皮LD50值＞2 000 mg/kg（雄、雌）[3-4]。目前尚未見有關(guān)烯肟菌酯原藥吸入毒性的報道。本研究通過對SD大鼠的急性吸入毒性試驗來測定烯肟菌酯原藥的急性吸入毒性，了解其經(jīng)呼吸道進入動物機體后對呼吸道及全身的損傷和危害程度，為烯肟菌酯的毒理學安全評價提供資料。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑與儀器

烯肟菌酯原藥為淡黃色固體，質(zhì)量分數(shù)90%，由沈陽化工研究院有限公司提供。

所用儀器有：HOPE-MED 8052H粉塵類口鼻多濃度動式染毒設(shè)備，購于天津開發(fā)區(qū)合普工貿(mào)有限公司；賽多利斯BS124S電子天平，購于杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；行星式高能球磨儀，購于德國萊弛公司；TY-08C智能個體粉塵取樣機，購于鹽城天悅儀器儀表有限公司；3321藥物氣溶膠粒徑譜儀系統(tǒng)，購于美國TSI公司。

1.2 動物來源與飼養(yǎng)環(huán)境

SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供（許可證號SCXK〈京〉2017—0011）。引入動物后進行適應(yīng)性檢查，適應(yīng)期每籠2只大鼠，適應(yīng)時間至少5 d，引入當天進行健康檢查，并稱量體重。飼料為滅菌全價營養(yǎng)粉料，自由飲水，動物房溫度為20.13～23.82℃，濕度為40.75%～69.89%，光周期自動控制，明暗各12 h/d。

1.3 試驗方法

1.3.1 劑量設(shè)計

參照經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）化學品測試導則《急性吸入毒性試驗：急性毒性分類法》要求及預(yù)試驗結(jié)果，試驗設(shè)4個劑量組，分別為5 000、2 000、1 000、500 mg/m3。根據(jù)大鼠體重采用隨機分組法分為4組，每組10只大鼠，雌雄各半。分組時組內(nèi)大鼠的體重應(yīng)控制在平均體重±20%之內(nèi)。

1.3.2 供試品的配制

5 000、2 000、1 000 mg/m3這3個劑量組，供試品用行星式球磨儀直接研磨成粉末后用于發(fā)生粉塵氣溶膠。500 mg/m3劑量組，供試品與氣相白炭黑（白色粉末，沈陽化工研究院有限公司生產(chǎn)）按質(zhì)量比90∶10混合研磨，發(fā)生氣溶膠。

1.3.3 染毒途徑及方法

使用HOPE-MED 8052H粉塵類口鼻多濃度動式染毒柜，雌雄大鼠各20只，隨機分成4個劑量組，每個劑量組雌雄大鼠各5只。將動物分別放入固定器內(nèi)，將固定器安裝到染毒柜上，然后密封染毒柜，定量進樣的供試品同空調(diào)過濾的壓縮空氣（0.04m3）吸入室內(nèi)混合，設(shè)定進樣速度和混合氣體流量，通過柜頂部的噴頭連續(xù)向柜內(nèi)發(fā)生氣溶膠，通過柜底部連接的尾氣吸收過濾裝置進行尾氣吸收。動物給藥前先對染毒柜內(nèi)質(zhì)量濃度進行調(diào)試，染毒柜內(nèi)質(zhì)量濃度2次連續(xù)檢測結(jié)果波動小于20%，進行正式試驗，動物暴露染毒時間為4 h。

1.3.4 給藥暴露參數(shù)檢測

染毒過程中對動物呼吸帶供試品實際質(zhì)量濃度和粒徑分布進行分析，對進氣流量、染毒柜溫度、相對濕度、氧氣濃度進行檢測。

質(zhì)量濃度測定：采樣前稱量濾膜重量為m1，采樣結(jié)束后稱量濾膜重量為m2，采樣質(zhì)量m=m2-m1，則氣溶膠質(zhì)量濃度C（mg/m3）=采樣質(zhì)量（m）/采樣體積（V）。

粒徑測定：使用藥物氣溶膠粒徑譜儀（3321）進行粒徑測定，主要測定粒子質(zhì)量中值空氣動力學直徑（MMAD）及粒子空氣動力學幾何標準差（GSD）。

1.3.5 動物觀察與體重稱量

染毒期間盡可能觀察固定器中動物的反應(yīng)，記錄染毒動物的臨床表現(xiàn)和體征。動物從固定器上取下時進行觀察，以后每天觀察1次，連續(xù)觀察14 d。

分別在分組時、給藥前稱量動物體重，并在給藥后第2、4、8天及以后每周和觀察期結(jié)束時稱量存活動物體重，試驗期間記錄死亡和瀕死動物體重。

1.3.6 病理學檢查

試驗期末對全部存活動物采用CO2進行麻醉，放血后進行大體解剖。解剖時對動物進行全面仔細的肉眼觀察，特別關(guān)注對肺部及上呼吸道的刺激及局部毒性反應(yīng)，同時檢查顱腔、胸腔、腹腔、各個天然孔道及其內(nèi)容物，詳細記錄每只動物的大體解剖結(jié)果。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果分析

分別統(tǒng)計各組動物的數(shù)目、癥狀、死亡、存活情況，大體解剖及組織病理學檢查的結(jié)果，計算不同組及不同性別動物上述各項的發(fā)生率及不同時間的體重均值和標準差。根據(jù)供試品濃度和動物死亡率，使用SPSS19.0軟件，采用概率單位回歸法計算急性吸入LC50值。根據(jù)LC50值，按照GHS標準（見表1）對供試品進行急性毒性分類。

表1 GHS急性吸入毒性分類標準

2 試驗結(jié)果

2.1 實際濃度與粒徑分布

暴露染毒期間染毒柜氣溶膠實際質(zhì)量濃度和粒徑分布測量結(jié)果見表2。4個劑量組實際質(zhì)量濃度分別為5 059、2 080、1 040、508 mg/m3。

表2 質(zhì)量濃度和粒徑分布結(jié)果

所有劑量組氣溶膠的MMAD值為2～3 μm，GSD值為2～3。

2.2 染毒期間染毒柜內(nèi)參數(shù)檢測

染毒期間對進氣流量、染毒柜溫度、相對濕度、氧氣體積分數(shù)進行檢測，檢測結(jié)果見表3。

表3 染毒期間染毒柜參數(shù)

2.3 癥狀觀察

當試驗劑量為5 000 mg/m3時，雄、雌大鼠試驗期間死亡率均為80%，20%的大鼠給藥后出現(xiàn)會陰污穢、少動、被毛蓬松和呼吸啰音等癥狀。雄大鼠藥后第4天癥狀消失；雌大鼠會陰污穢、被毛蓬松和少動等癥狀藥后第3天消失，呼吸啰音第5天消失。當劑量為2 000 mg/m3時，雄、雌大鼠均在給藥后第2天出現(xiàn)死亡情況，其中雄鼠死亡率為40%，雌鼠死亡率為20%；各有60%和80%的雄、雌大鼠出現(xiàn)會陰污穢和少動等癥狀，第3天癥狀消失。當劑量為1 000 mg/m3時，雄、雌大鼠均無死亡；20%的雄大鼠出現(xiàn)被毛蓬松，40%的雌大鼠出現(xiàn)少動和會陰污穢癥狀，藥后第3天癥狀消失，其余正常；當劑量為500 mg/m3時，大鼠給藥后未出現(xiàn)死亡，也無其他癥狀。具體觀察結(jié)果見表4。

2.4 體重稱量結(jié)果

給藥后第2天所有存活動物的體重都降低，其5 000 mg/m3劑量組存活大鼠體重于第8天恢復正常。體重稱量結(jié)果見表5。

表4 染毒后大鼠癥狀

表5 體重稱量結(jié)果g

2.5 解剖與組織學觀察結(jié)果

5 000、2 000 mg/m3劑量組大鼠死亡解剖發(fā)現(xiàn)，肝臟呈暗紅色，肺部出現(xiàn)紅斑；大體解剖發(fā)現(xiàn)肺臟有大面積紅色斑點，且大鼠組織出現(xiàn)淤點癥狀。1000、500 mg/m3劑量組動物有3例肝臟呈暗紅色，其他解剖未見異常。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)烯肟菌酯質(zhì)量濃度和動物死亡率，使用SPSS19.0軟件，采用概率單位法計算急性吸入LC50值。雄大鼠急性吸入毒性LC50值為2 760 mg/m3，雌大鼠為3 208 mg/m3。根據(jù)烯肟菌酯對大鼠急性經(jīng)口LD50值、大鼠急性經(jīng)皮LD50值，同時根據(jù)GHS標準，對烯肟菌酯進行急性毒性分級。烯肟菌酯原藥急性吸入毒性為4級，屬于低毒農(nóng)藥。

隨著農(nóng)業(yè)發(fā)展水平的提高，我國創(chuàng)制農(nóng)藥越來越多，農(nóng)藥的安全性問題也越來越受關(guān)注。烯肟菌酯殺菌活性高，殺菌譜廣，與環(huán)境相容性好，具有較好的市場開發(fā)潛力[5-6]。關(guān)于烯肟菌酯的急性吸入毒性尚未見報道，本試驗通過對SD大鼠的急性吸入毒性試驗來測定烯肟菌酯原藥急性吸入毒性。結(jié)果表明，烯肟菌酯低毒，若制成有效噴霧藥劑，不僅提高了藥物的吸收速度，而且避免其他給藥途徑帶來的不良影響，極大提升了用藥的安全性。