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    釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取及抗氧化、抗腫瘤活性研究

    2018-08-10 02:16:56王虹玲于子簫康振宇趙奕彭康宗利
    中國(guó)釀造 2018年7期
    關(guān)鍵詞:皮渣超氧液固比

    王虹玲,吳 優(yōu),于子簫,康振宇,趙奕彭,康宗利*

    (1.沈陽(yáng)工學(xué)院 生命工程學(xué)院,遼寧 撫順 113122;2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110866;3.西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川 綿陽(yáng) 621010)

    釀酒葡萄皮渣中含有大量與葡萄酒類似的生物活性物質(zhì),尤以多酚類化合物為主(如白藜蘆醇、原花青素、酒石酸等),這些物質(zhì)都具有較強(qiáng)的抗氧化、抑菌、抗腫瘤、抗衰老等生物活性,已成為世界性的重要營(yíng)養(yǎng)兼藥用的商品[1-5]。白藜蘆醇是含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物,主要存在于葡萄屬、花生屬等植物中,以虎杖、葡萄中含量最多,而在葡萄中又以葡萄皮中的含量最高[6-10]。

    目前,白藜蘆醇提取常見的方法有有機(jī)溶劑提取法、超聲波提取法、微波輔助法、酶解法等。由于自然界中白藜蘆醇的含量較低,通常在提取前需要對(duì)提取對(duì)象進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化,如將樣本中的白藜蘆醇苷和白藜蘆醇多聚體衍生物通過(guò)酸堿水解或酶解轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇,可大大提高白藜蘆醇提取率[11-12]。

    本研究以自釀葡萄酒發(fā)酵后的皮渣為原材料,將皮渣干燥后磨粉過(guò)篩,利用纖維素酶解法在不同條件下進(jìn)行白藜蘆醇的提取,并對(duì)提取得到的白藜蘆醇進(jìn)行抗氧化及體外抗腫瘤活性分析,以期為葡萄皮渣資源的利用以及白藜蘆醇產(chǎn)品的深度開發(fā)奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    釀酒葡萄皮渣:康美爾葡萄經(jīng)葡萄酒發(fā)酵后濾出清液所得。人宮頸癌Hela細(xì)胞、人肺癌A549細(xì)胞、人前列腺癌PC-3細(xì)胞:均由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)提供。

    白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純),纖維素酶(酶活105U/g)、鄰二氮菲、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵、1,1-二苯基-2-硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、硝酸鋁、乙酸乙酯(均為分析純):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    RE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:予華儀器有限公司;W200IR型CO2培養(yǎng)箱:美國(guó)SIM公司;TS-100倒置顯微鏡:日本Nikon公司;Stat Fax-3200酶標(biāo)儀:美國(guó)AWARENESS公司;1-15K高速冷凍離心機(jī):德國(guó)Sigma公司。

    1.3 方法

    1.3.1 工藝流程及操作要點(diǎn)

    操作要點(diǎn):

    釀酒葡萄皮渣粉末:新鮮釀酒葡萄皮渣經(jīng)紗布過(guò)濾去除殘余水分后,50℃烘干至質(zhì)量恒定,經(jīng)粉碎機(jī)粉碎,過(guò)40目篩,得到的皮渣粉,末加入石油醚進(jìn)行脫脂處理;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除石油醚,得到的葡萄皮渣粉末裝入密封容器內(nèi)備用。

    纖維素酶解:準(zhǔn)確稱取釀酒葡萄皮渣粉末1.0g于100mL燒杯中,加入一定量的蒸餾水和纖維素酶在50℃、pH 5.0條件下酶解1 h。

    體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸提:酶解后加入一定量體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇,浸提一段時(shí)間后離心去除濾渣。

    白藜蘆醇粗提液:濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇,得到白藜蘆醇粗提液。

    白藜蘆醇浸膏:白藜蘆醇粗提液中加入乙酸乙酯,反復(fù)萃取3次,合并乙酸乙酯相,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙酸乙酯,得到白藜蘆醇浸膏。

    目標(biāo)產(chǎn)物:白藜蘆醇浸膏于50℃條件下烘干至質(zhì)量恒定,進(jìn)行含量測(cè)定。

    1.3.2 白藜蘆醇提取工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

    以釀酒葡萄皮渣為原料,分別以纖維素酶添加量(30U/μL、50U/μL、70U/μL、90U/μL、110U/μL、130U/μL)、體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇與葡萄皮渣液固比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1(mL∶g))、酶解時(shí)間(30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min)、酶解溫度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60℃、70℃、80℃)為評(píng)價(jià)因素,白藜蘆醇提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),進(jìn)行釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取的單因素試驗(yàn)。

    1.3.3 白藜蘆醇提取工藝優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn)

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)(central composite design,CCD)的設(shè)計(jì)原理,利用Design Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì),以酶添加量(A)、液固比(B)、酶解時(shí)間(C)、酶解溫度(D)為考察因素,以釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率(Y)為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)化酶解條件。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

    表1 釀酒葡萄皮渣酶解條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for wine grape pomace hydrolysis conditions optimization

    1.3.4 測(cè)定方法

    白藜蘆醇含量:參照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行測(cè)定;

    DPPH自由基清除能力:以維生素C(vitamin C,VC)作為對(duì)照,參照文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行測(cè)定;

    超氧陰離子自由基清除能力:以VC作為對(duì)照,參照文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行測(cè)定;

    體外抗腫瘤活性:參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行測(cè)定。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 白藜蘆醇提取工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 酶添加量對(duì)釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率的影響

    圖1 纖維素酶添加量對(duì)白藜蘆醇提取率的影響Fig.1 Effect of cellulase addition on the extraction rate of resveratrol

    由圖1可知,白藜蘆醇提取率隨酶添加量的增加呈現(xiàn)先升高后平穩(wěn)的趨勢(shì);當(dāng)酶的添加量為70 U/μL時(shí),白藜蘆醇提取率達(dá)到最高,為142.82 μg/g。繼續(xù)增加酶添加量,葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取率并沒有明顯提高。表明此時(shí)溶液中酶的添加量已近于飽和。因此,選擇酶添加量為70 U/μL進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

    2.1.2 液固比對(duì)釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率的影響

    由圖2可知,白藜蘆醇提取率隨液固比的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì);當(dāng)液固比為25∶1(mL∶g)時(shí),白藜蘆醇提取率達(dá)到最高,為139.82 μg/g。繼續(xù)增加液固比,反應(yīng)體系中酶的濃度逐漸稀釋,降低了酶解作用效果,導(dǎo)致白藜蘆醇提取率逐漸降低。因此選擇液固比為25∶1(mL∶g)。

    圖2 液固比對(duì)白藜蘆醇提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of resveratrol

    2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率的影響

    圖3 酶解時(shí)間對(duì)白藜蘆醇提取率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on the extraction rate of resveratrol

    由圖3可知,白藜蘆醇提取率隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后平穩(wěn)的趨勢(shì);當(dāng)酶解時(shí)間為90 min時(shí),白藜蘆醇提取率達(dá)到最高,為142.48 μg/g。繼續(xù)增加酶解時(shí)間,葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取率并沒有明顯提高。此時(shí),細(xì)胞壁已基本被破壞,再延長(zhǎng)酶解時(shí)間對(duì)試驗(yàn)效果影響不顯著(P>0.05)。因此選擇酶解時(shí)間為90 min。

    2.1.4 酶解溫度對(duì)釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率的影響

    圖4 酶解溫度對(duì)白藜蘆醇提取率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the extraction rate of resveratrol

    由圖4可知,白藜蘆醇提取率隨酶解溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì);當(dāng)酶解溫度為50℃時(shí),白藜蘆醇提取率達(dá)到最高,為129.63 μg/g。當(dāng)酶解溫度>50℃時(shí),酶的活性受到嚴(yán)重影響,高溫破壞了酶的結(jié)構(gòu),影響了酶對(duì)細(xì)胞壁的分解作用,抑制了白藜蘆醇的提取。因此,選擇酶解溫度為50℃。

    2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取工藝

    2.2.1 回歸模型的建立及方差分析

    響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析分別見表2和表3。

    表2 釀酒葡萄皮渣酶解條件優(yōu)化響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of response surface methodology for wine grape pomace hydrolysis conditions optimization

    從表3可以看出,回歸模型極顯著(P<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05),模型調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.9193,R2=0.9583,表明該模型與試驗(yàn)擬合較好,可以用于葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率的預(yù)測(cè)。從回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知,各試驗(yàn)因素對(duì)白藜蘆醇提取率的影響為A>B>C>D,交互項(xiàng)除AD外其余各項(xiàng)均極顯著(P<0.01),二次項(xiàng)除C2外均極顯著(P<0.01)。模型所預(yù)測(cè)的最優(yōu)提取條件為酶添加量70.16 U/μL,酶解時(shí)間148.43 min,酶解溫度39.80 ℃,液固比18.16∶1(mL∶g),在此條件下,白藜蘆醇的提取量為141.48 μg/g。

    表3 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of regression model

    對(duì)各試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸擬合,得到回歸模型方程為:Y=139.46+5.76A-4.91B+1.20C-0.78D+3.98AB+4.13AC+2.01AD+-9.84BC-4.98BD-5.46CD-5.36A2-3.99B2-1.29C2+2.48D2

    2.2.2 交互作用分析

    釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取工藝優(yōu)化的響應(yīng)面及等高線圖如圖5所示。

    由圖5可知,酶添加量和液固比的交互作用對(duì)白藜蘆醇的提取量影響極顯著(P<0.01);在一定的液固比條件下,提取量隨酶添加量的增大呈先增大后減小的趨勢(shì)。酶添加量和酶解時(shí)間的交互作用對(duì)白藜蘆醇的提取量影響極顯著(P<0.01);在不同的酶解時(shí)間下,提取量隨酶添加量的升高而逐漸降低。固液比和酶解溫度的交互作用對(duì)白藜蘆醇的提取量影響極顯著(P<0.01);在一定酶解溫度條件下,提取量隨液固比的增大呈先增大后減小的趨勢(shì)。酶解時(shí)間和酶解溫度的交互作用對(duì)白藜蘆醇的提取量影響極顯著(P<0.01);在一定的酶解溫度下,提取量隨酶解時(shí)間的增大呈逐漸減少的趨勢(shì)。液固比和酶解時(shí)間的交互作用對(duì)白藜蘆醇的提取量影響極顯著(P<0.01);在不同的液固比條件下,提取量隨酶解時(shí)間的增大而逐漸減少。

    圖5 酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度、液固比交互作用對(duì)釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇含量影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between cellulase addition,enzymolysis time,temperature and solid-liquid ratio on resveratrol content from wine grape pomace

    2.2.3 最佳提取條件驗(yàn)證試驗(yàn)

    根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化得到的結(jié)果,結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)操作,將考察因素設(shè)定為酶添加量為70 U/μL,酶解時(shí)間為150 min,酶解溫度為40 ℃,液固比為20∶1(mL∶g),重復(fù)3次試驗(yàn),得到葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取率為144.13 μg/g,與模型預(yù)測(cè)值141.48 μg/g接近,證實(shí)了模型的有效性。

    2.3 葡萄皮渣中白藜蘆醇的抗氧化活性分析

    由圖6A可知,VC和白藜蘆醇均對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除效果,且清除率隨抗氧化劑濃度的增加而呈上升趨勢(shì)。其中VC在試驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基的清除效果優(yōu)于白藜蘆醇,當(dāng)質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時(shí),VC的清除率可達(dá)(88.03±2.251)%,白藜蘆醇的清除率為(65.12±3.882)%。

    圖6 不同質(zhì)量濃度的VC及白藜蘆醇對(duì)DPPH(A)和超氧陰離子(B)自由基的清除效果Fig.6 Scavenging capacities of different concentrations of VC and resveratrol on DPPH free(A)and superoxide anion(B)free radicals

    由圖6B可知,不同濃度的白藜蘆醇均具有一定的清除超氧陰離子自由基的能力,并隨質(zhì)量濃度的不斷增大,清除率逐漸升高,當(dāng)質(zhì)量濃度為1.2mg/mL時(shí)白藜蘆醇對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到最大,為(54.13±3.105)%,陽(yáng)性對(duì)照VC對(duì)超氧陰離子自由基的最大清除率為(86.58±2.975)%。白藜蘆醇對(duì)超氧陰離子自由基的抗氧化性雖不及VC,但也表現(xiàn)出一定的清除效果。

    2.4 葡萄皮渣中白藜蘆醇的體外抗腫瘤活性分析

    采用MTT法測(cè)定葡萄皮渣中白藜蘆醇對(duì)3種癌細(xì)胞Hela、A549和PC-3的體外抑制活性,并根據(jù)抑制率計(jì)算半抑制濃度(50%inhibiting concentration,IC50)值,結(jié)果見表4。

    表4 白藜蘆醇對(duì)3種腫瘤細(xì)胞株的IC50值Table 4 IC50value of the three tumor cell strains treated with resveratrol

    由表4可知,白藜蘆醇對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞的抑制最為顯著,IC50值最小,為25.31 μmol/L;對(duì)Hela細(xì)胞和A549細(xì)胞的IC50值分別為128.29 μmol/L和108.35 μmol/L。

    3 結(jié)論

    本研究采用纖維素酶水解法對(duì)釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,確定最優(yōu)提取條件為酶添加量70 U/μL,酶解時(shí)間150 min,酶解溫度40 ℃,液固比20∶1(mL∶g),重復(fù)3次試驗(yàn),得到葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取率為144.13 μg/g。

    抗氧化試驗(yàn)結(jié)果顯示,釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子自由基均具有較好的清除作用,在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),清除率隨濃度的增加而升高。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH和超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到(65.12±3.882)%和(54.13±3.105)%,表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。

    體外抗腫瘤試驗(yàn)結(jié)果表明,釀酒葡萄皮渣中的白藜蘆醇對(duì)Hela、A549和PC-3細(xì)胞的增長(zhǎng)具有抑制作用,其IC50值分別為128.29μmol/L、108.35 μmol/L和25.31 μmol/L,表現(xiàn)出一定的體外抗腫瘤活性。

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