• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取及抗氧化、抗腫瘤活性研究

    2018-08-10 02:16:56王虹玲于子簫康振宇趙奕彭康宗利
    中國(guó)釀造 2018年7期
    關(guān)鍵詞:皮渣超氧液固比

    王虹玲,吳 優(yōu),于子簫,康振宇,趙奕彭,康宗利*

    (1.沈陽(yáng)工學(xué)院 生命工程學(xué)院,遼寧 撫順 113122;2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110866;3.西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川 綿陽(yáng) 621010)

    釀酒葡萄皮渣中含有大量與葡萄酒類似的生物活性物質(zhì),尤以多酚類化合物為主(如白藜蘆醇、原花青素、酒石酸等),這些物質(zhì)都具有較強(qiáng)的抗氧化、抑菌、抗腫瘤、抗衰老等生物活性,已成為世界性的重要營(yíng)養(yǎng)兼藥用的商品[1-5]。白藜蘆醇是含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物,主要存在于葡萄屬、花生屬等植物中,以虎杖、葡萄中含量最多,而在葡萄中又以葡萄皮中的含量最高[6-10]。

    目前,白藜蘆醇提取常見的方法有有機(jī)溶劑提取法、超聲波提取法、微波輔助法、酶解法等。由于自然界中白藜蘆醇的含量較低,通常在提取前需要對(duì)提取對(duì)象進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化,如將樣本中的白藜蘆醇苷和白藜蘆醇多聚體衍生物通過(guò)酸堿水解或酶解轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇,可大大提高白藜蘆醇提取率[11-12]。

    本研究以自釀葡萄酒發(fā)酵后的皮渣為原材料,將皮渣干燥后磨粉過(guò)篩,利用纖維素酶解法在不同條件下進(jìn)行白藜蘆醇的提取,并對(duì)提取得到的白藜蘆醇進(jìn)行抗氧化及體外抗腫瘤活性分析,以期為葡萄皮渣資源的利用以及白藜蘆醇產(chǎn)品的深度開發(fā)奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    釀酒葡萄皮渣:康美爾葡萄經(jīng)葡萄酒發(fā)酵后濾出清液所得。人宮頸癌Hela細(xì)胞、人肺癌A549細(xì)胞、人前列腺癌PC-3細(xì)胞:均由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)提供。

    白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純),纖維素酶(酶活105U/g)、鄰二氮菲、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵、1,1-二苯基-2-硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、硝酸鋁、乙酸乙酯(均為分析純):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    RE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:予華儀器有限公司;W200IR型CO2培養(yǎng)箱:美國(guó)SIM公司;TS-100倒置顯微鏡:日本Nikon公司;Stat Fax-3200酶標(biāo)儀:美國(guó)AWARENESS公司;1-15K高速冷凍離心機(jī):德國(guó)Sigma公司。

    1.3 方法

    1.3.1 工藝流程及操作要點(diǎn)

    操作要點(diǎn):

    釀酒葡萄皮渣粉末:新鮮釀酒葡萄皮渣經(jīng)紗布過(guò)濾去除殘余水分后,50℃烘干至質(zhì)量恒定,經(jīng)粉碎機(jī)粉碎,過(guò)40目篩,得到的皮渣粉,末加入石油醚進(jìn)行脫脂處理;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除石油醚,得到的葡萄皮渣粉末裝入密封容器內(nèi)備用。

    纖維素酶解:準(zhǔn)確稱取釀酒葡萄皮渣粉末1.0g于100mL燒杯中,加入一定量的蒸餾水和纖維素酶在50℃、pH 5.0條件下酶解1 h。

    體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸提:酶解后加入一定量體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇,浸提一段時(shí)間后離心去除濾渣。

    白藜蘆醇粗提液:濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇,得到白藜蘆醇粗提液。

    白藜蘆醇浸膏:白藜蘆醇粗提液中加入乙酸乙酯,反復(fù)萃取3次,合并乙酸乙酯相,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙酸乙酯,得到白藜蘆醇浸膏。

    目標(biāo)產(chǎn)物:白藜蘆醇浸膏于50℃條件下烘干至質(zhì)量恒定,進(jìn)行含量測(cè)定。

    1.3.2 白藜蘆醇提取工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

    以釀酒葡萄皮渣為原料,分別以纖維素酶添加量(30U/μL、50U/μL、70U/μL、90U/μL、110U/μL、130U/μL)、體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇與葡萄皮渣液固比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1(mL∶g))、酶解時(shí)間(30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min)、酶解溫度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60℃、70℃、80℃)為評(píng)價(jià)因素,白藜蘆醇提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),進(jìn)行釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取的單因素試驗(yàn)。

    1.3.3 白藜蘆醇提取工藝優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn)

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)(central composite design,CCD)的設(shè)計(jì)原理,利用Design Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì),以酶添加量(A)、液固比(B)、酶解時(shí)間(C)、酶解溫度(D)為考察因素,以釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率(Y)為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)化酶解條件。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

    表1 釀酒葡萄皮渣酶解條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for wine grape pomace hydrolysis conditions optimization

    1.3.4 測(cè)定方法

    白藜蘆醇含量:參照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行測(cè)定;

    DPPH自由基清除能力:以維生素C(vitamin C,VC)作為對(duì)照,參照文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行測(cè)定;

    超氧陰離子自由基清除能力:以VC作為對(duì)照,參照文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行測(cè)定;

    體外抗腫瘤活性:參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行測(cè)定。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 白藜蘆醇提取工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 酶添加量對(duì)釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率的影響

    圖1 纖維素酶添加量對(duì)白藜蘆醇提取率的影響Fig.1 Effect of cellulase addition on the extraction rate of resveratrol

    由圖1可知,白藜蘆醇提取率隨酶添加量的增加呈現(xiàn)先升高后平穩(wěn)的趨勢(shì);當(dāng)酶的添加量為70 U/μL時(shí),白藜蘆醇提取率達(dá)到最高,為142.82 μg/g。繼續(xù)增加酶添加量,葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取率并沒有明顯提高。表明此時(shí)溶液中酶的添加量已近于飽和。因此,選擇酶添加量為70 U/μL進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

    2.1.2 液固比對(duì)釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率的影響

    由圖2可知,白藜蘆醇提取率隨液固比的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì);當(dāng)液固比為25∶1(mL∶g)時(shí),白藜蘆醇提取率達(dá)到最高,為139.82 μg/g。繼續(xù)增加液固比,反應(yīng)體系中酶的濃度逐漸稀釋,降低了酶解作用效果,導(dǎo)致白藜蘆醇提取率逐漸降低。因此選擇液固比為25∶1(mL∶g)。

    圖2 液固比對(duì)白藜蘆醇提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of resveratrol

    2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率的影響

    圖3 酶解時(shí)間對(duì)白藜蘆醇提取率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on the extraction rate of resveratrol

    由圖3可知,白藜蘆醇提取率隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后平穩(wěn)的趨勢(shì);當(dāng)酶解時(shí)間為90 min時(shí),白藜蘆醇提取率達(dá)到最高,為142.48 μg/g。繼續(xù)增加酶解時(shí)間,葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取率并沒有明顯提高。此時(shí),細(xì)胞壁已基本被破壞,再延長(zhǎng)酶解時(shí)間對(duì)試驗(yàn)效果影響不顯著(P>0.05)。因此選擇酶解時(shí)間為90 min。

    2.1.4 酶解溫度對(duì)釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率的影響

    圖4 酶解溫度對(duì)白藜蘆醇提取率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the extraction rate of resveratrol

    由圖4可知,白藜蘆醇提取率隨酶解溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì);當(dāng)酶解溫度為50℃時(shí),白藜蘆醇提取率達(dá)到最高,為129.63 μg/g。當(dāng)酶解溫度>50℃時(shí),酶的活性受到嚴(yán)重影響,高溫破壞了酶的結(jié)構(gòu),影響了酶對(duì)細(xì)胞壁的分解作用,抑制了白藜蘆醇的提取。因此,選擇酶解溫度為50℃。

    2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取工藝

    2.2.1 回歸模型的建立及方差分析

    響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析分別見表2和表3。

    表2 釀酒葡萄皮渣酶解條件優(yōu)化響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of response surface methodology for wine grape pomace hydrolysis conditions optimization

    從表3可以看出,回歸模型極顯著(P<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05),模型調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.9193,R2=0.9583,表明該模型與試驗(yàn)擬合較好,可以用于葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率的預(yù)測(cè)。從回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知,各試驗(yàn)因素對(duì)白藜蘆醇提取率的影響為A>B>C>D,交互項(xiàng)除AD外其余各項(xiàng)均極顯著(P<0.01),二次項(xiàng)除C2外均極顯著(P<0.01)。模型所預(yù)測(cè)的最優(yōu)提取條件為酶添加量70.16 U/μL,酶解時(shí)間148.43 min,酶解溫度39.80 ℃,液固比18.16∶1(mL∶g),在此條件下,白藜蘆醇的提取量為141.48 μg/g。

    表3 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of regression model

    對(duì)各試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸擬合,得到回歸模型方程為:Y=139.46+5.76A-4.91B+1.20C-0.78D+3.98AB+4.13AC+2.01AD+-9.84BC-4.98BD-5.46CD-5.36A2-3.99B2-1.29C2+2.48D2

    2.2.2 交互作用分析

    釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取工藝優(yōu)化的響應(yīng)面及等高線圖如圖5所示。

    由圖5可知,酶添加量和液固比的交互作用對(duì)白藜蘆醇的提取量影響極顯著(P<0.01);在一定的液固比條件下,提取量隨酶添加量的增大呈先增大后減小的趨勢(shì)。酶添加量和酶解時(shí)間的交互作用對(duì)白藜蘆醇的提取量影響極顯著(P<0.01);在不同的酶解時(shí)間下,提取量隨酶添加量的升高而逐漸降低。固液比和酶解溫度的交互作用對(duì)白藜蘆醇的提取量影響極顯著(P<0.01);在一定酶解溫度條件下,提取量隨液固比的增大呈先增大后減小的趨勢(shì)。酶解時(shí)間和酶解溫度的交互作用對(duì)白藜蘆醇的提取量影響極顯著(P<0.01);在一定的酶解溫度下,提取量隨酶解時(shí)間的增大呈逐漸減少的趨勢(shì)。液固比和酶解時(shí)間的交互作用對(duì)白藜蘆醇的提取量影響極顯著(P<0.01);在不同的液固比條件下,提取量隨酶解時(shí)間的增大而逐漸減少。

    圖5 酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度、液固比交互作用對(duì)釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇含量影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between cellulase addition,enzymolysis time,temperature and solid-liquid ratio on resveratrol content from wine grape pomace

    2.2.3 最佳提取條件驗(yàn)證試驗(yàn)

    根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化得到的結(jié)果,結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)操作,將考察因素設(shè)定為酶添加量為70 U/μL,酶解時(shí)間為150 min,酶解溫度為40 ℃,液固比為20∶1(mL∶g),重復(fù)3次試驗(yàn),得到葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取率為144.13 μg/g,與模型預(yù)測(cè)值141.48 μg/g接近,證實(shí)了模型的有效性。

    2.3 葡萄皮渣中白藜蘆醇的抗氧化活性分析

    由圖6A可知,VC和白藜蘆醇均對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除效果,且清除率隨抗氧化劑濃度的增加而呈上升趨勢(shì)。其中VC在試驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基的清除效果優(yōu)于白藜蘆醇,當(dāng)質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時(shí),VC的清除率可達(dá)(88.03±2.251)%,白藜蘆醇的清除率為(65.12±3.882)%。

    圖6 不同質(zhì)量濃度的VC及白藜蘆醇對(duì)DPPH(A)和超氧陰離子(B)自由基的清除效果Fig.6 Scavenging capacities of different concentrations of VC and resveratrol on DPPH free(A)and superoxide anion(B)free radicals

    由圖6B可知,不同濃度的白藜蘆醇均具有一定的清除超氧陰離子自由基的能力,并隨質(zhì)量濃度的不斷增大,清除率逐漸升高,當(dāng)質(zhì)量濃度為1.2mg/mL時(shí)白藜蘆醇對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到最大,為(54.13±3.105)%,陽(yáng)性對(duì)照VC對(duì)超氧陰離子自由基的最大清除率為(86.58±2.975)%。白藜蘆醇對(duì)超氧陰離子自由基的抗氧化性雖不及VC,但也表現(xiàn)出一定的清除效果。

    2.4 葡萄皮渣中白藜蘆醇的體外抗腫瘤活性分析

    采用MTT法測(cè)定葡萄皮渣中白藜蘆醇對(duì)3種癌細(xì)胞Hela、A549和PC-3的體外抑制活性,并根據(jù)抑制率計(jì)算半抑制濃度(50%inhibiting concentration,IC50)值,結(jié)果見表4。

    表4 白藜蘆醇對(duì)3種腫瘤細(xì)胞株的IC50值Table 4 IC50value of the three tumor cell strains treated with resveratrol

    由表4可知,白藜蘆醇對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞的抑制最為顯著,IC50值最小,為25.31 μmol/L;對(duì)Hela細(xì)胞和A549細(xì)胞的IC50值分別為128.29 μmol/L和108.35 μmol/L。

    3 結(jié)論

    本研究采用纖維素酶水解法對(duì)釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,確定最優(yōu)提取條件為酶添加量70 U/μL,酶解時(shí)間150 min,酶解溫度40 ℃,液固比20∶1(mL∶g),重復(fù)3次試驗(yàn),得到葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取率為144.13 μg/g。

    抗氧化試驗(yàn)結(jié)果顯示,釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子自由基均具有較好的清除作用,在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),清除率隨濃度的增加而升高。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH和超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到(65.12±3.882)%和(54.13±3.105)%,表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。

    體外抗腫瘤試驗(yàn)結(jié)果表明,釀酒葡萄皮渣中的白藜蘆醇對(duì)Hela、A549和PC-3細(xì)胞的增長(zhǎng)具有抑制作用,其IC50值分別為128.29μmol/L、108.35 μmol/L和25.31 μmol/L,表現(xiàn)出一定的體外抗腫瘤活性。

    猜你喜歡
    皮渣超氧液固比
    Dynamics of forest biomass carbon stocks from 1949 to 2008 in Henan Province,east-central China
    Statistics
    China Textile(2017年10期)2017-12-25 12:43:00
    二氧化鈦光催化產(chǎn)生超氧自由基的形態(tài)分布研究
    熒光/化學(xué)發(fā)光探針成像檢測(cè)超氧陰離子自由基的研究進(jìn)展
    精細(xì)化控制提高重介旋流器分選效率的研究
    某砂巖型鈾礦床礦石酸法柱浸試驗(yàn)研究
    柑橘皮渣“變身”飼料
    皮渣燴菜
    中老年健康(2015年8期)2015-05-30 10:48:04
    增設(shè)原煤灰分儀提高末煤系統(tǒng)的精細(xì)化控制
    辣椒素對(duì)茶油的抗氧化與清除超氧陰離子自由基活性研究
    国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲精品久久国产高清桃花| 日本a在线网址| 嫩草影院入口| 久久亚洲精品不卡| 亚洲精品亚洲一区二区| 婷婷精品国产亚洲av| 日韩成人伦理影院| 亚洲成av人片在线播放无| 国产免费男女视频| 国产黄片美女视频| 亚洲电影在线观看av| 欧美+亚洲+日韩+国产| 色在线成人网| 美女免费视频网站| 我的女老师完整版在线观看| 久久精品影院6| 波多野结衣高清作品| 国产黄a三级三级三级人| 久久久久久久午夜电影| 一级毛片久久久久久久久女| 免费搜索国产男女视频| 亚洲欧美清纯卡通| 国内精品宾馆在线| 国产麻豆成人av免费视频| 久久久国产成人精品二区| 欧美极品一区二区三区四区| 在线播放国产精品三级| 国产探花在线观看一区二区| 欧美高清成人免费视频www| 天天一区二区日本电影三级| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产三级在线视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲精品色激情综合| 色哟哟·www| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 在现免费观看毛片| 韩国av在线不卡| 国产精品久久电影中文字幕| 精品久久久久久久久久免费视频| 中文字幕av在线有码专区| 日韩国内少妇激情av| 99视频精品全部免费 在线| 中文字幕av成人在线电影| 搡老岳熟女国产| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产一区二区三区av在线 | 免费高清视频大片| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲七黄色美女视频| 一本一本综合久久| 亚洲一区高清亚洲精品| 内地一区二区视频在线| 久久久久久久亚洲中文字幕| 欧美高清成人免费视频www| 免费无遮挡裸体视频| 1000部很黄的大片| 国产精品无大码| 美女黄网站色视频| 中国国产av一级| 中国美女看黄片| 久久精品国产亚洲网站| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 久久久精品大字幕| 国产午夜精品论理片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久久久久九九精品二区国产| 一级a爱片免费观看的视频| 亚州av有码| 欧美一区二区亚洲| 嫩草影院入口| 少妇人妻精品综合一区二区 | 亚洲国产精品成人久久小说 | 乱码一卡2卡4卡精品| 中文字幕av在线有码专区| 三级经典国产精品| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美日韩精品成人综合77777| 天堂动漫精品| 欧美日韩乱码在线| 亚洲欧美日韩高清专用| aaaaa片日本免费| 天堂影院成人在线观看| 在线国产一区二区在线| .国产精品久久| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 精品国产三级普通话版| 亚洲内射少妇av| 国产成人a∨麻豆精品| 久99久视频精品免费| 高清毛片免费看| 日韩欧美在线乱码| 精品不卡国产一区二区三区| 国产爱豆传媒在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 长腿黑丝高跟| 一区二区三区四区激情视频 | 成人鲁丝片一二三区免费| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 搡老熟女国产l中国老女人| 少妇的逼好多水| 成人漫画全彩无遮挡| 俺也久久电影网| 亚洲精品456在线播放app| 丝袜喷水一区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产视频一区二区在线看| 国产av在哪里看| 五月玫瑰六月丁香| 欧美激情在线99| 三级毛片av免费| 一本精品99久久精品77| 欧美日本视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产真实伦视频高清在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 观看美女的网站| 简卡轻食公司| 成人亚洲精品av一区二区| 看黄色毛片网站| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产一区二区三区av在线 | 在线免费观看的www视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 简卡轻食公司| 在线播放国产精品三级| 国产精品亚洲美女久久久| 国产免费一级a男人的天堂| 久久这里只有精品中国| 中文字幕熟女人妻在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲av不卡在线观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 一级黄色大片毛片| 久久精品人妻少妇| 亚洲av免费在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 国产av一区在线观看免费| 搡老熟女国产l中国老女人| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 深爱激情五月婷婷| 麻豆国产av国片精品| 中文在线观看免费www的网站| 不卡视频在线观看欧美| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲av美国av| 色播亚洲综合网| 久久久国产成人精品二区| 国产精品野战在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 欧美日韩精品成人综合77777| 床上黄色一级片| 俺也久久电影网| 亚洲不卡免费看| 亚洲,欧美,日韩| 日韩精品青青久久久久久| 国产成年人精品一区二区| av卡一久久| 干丝袜人妻中文字幕| 久久久欧美国产精品| 人妻夜夜爽99麻豆av| 精品一区二区免费观看| а√天堂www在线а√下载| 少妇人妻精品综合一区二区 | 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产av麻豆久久久久久久| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲美女视频黄频| 偷拍熟女少妇极品色| 国产美女午夜福利| 精品久久久久久久久久免费视频| 一级黄色大片毛片| 少妇丰满av| 欧美性感艳星| 午夜激情福利司机影院| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲专区国产一区二区| 3wmmmm亚洲av在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 秋霞在线观看毛片| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 麻豆久久精品国产亚洲av| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 成人av一区二区三区在线看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 少妇高潮的动态图| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲在线观看片| 欧美三级亚洲精品| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产精品一二三区在线看| 日韩欧美在线乱码| 中文字幕av成人在线电影| АⅤ资源中文在线天堂| 精品欧美国产一区二区三| 久久久精品大字幕| 欧美三级亚洲精品| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 日韩强制内射视频| 亚洲成人久久爱视频| 精品久久久噜噜| 永久网站在线| 黑人高潮一二区| 免费观看的影片在线观看| av黄色大香蕉| 女同久久另类99精品国产91| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 免费人成视频x8x8入口观看| 如何舔出高潮| 亚洲欧美日韩东京热| 日本与韩国留学比较| 俄罗斯特黄特色一大片| av在线蜜桃| 久久久成人免费电影| 在线观看美女被高潮喷水网站| 美女 人体艺术 gogo| 男女那种视频在线观看| 亚洲色图av天堂| 亚洲精品日韩av片在线观看| 一级毛片电影观看 | 成人二区视频| 99精品在免费线老司机午夜| 九九在线视频观看精品| 欧美bdsm另类| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久精品国产亚洲网站| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产午夜福利久久久久久| 国产成人91sexporn| av视频在线观看入口| 麻豆av噜噜一区二区三区| a级一级毛片免费在线观看| 免费观看在线日韩| 热99在线观看视频| 岛国在线免费视频观看| 秋霞在线观看毛片| 免费人成在线观看视频色| 全区人妻精品视频| 欧美bdsm另类| 久久久久久国产a免费观看| 99久国产av精品国产电影| 亚洲国产精品国产精品| 黄色一级大片看看| 国产精品福利在线免费观看| 长腿黑丝高跟| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲第一电影网av| 少妇高潮的动态图| 国产精品无大码| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产69精品久久久久777片| 联通29元200g的流量卡| 亚洲电影在线观看av| 色综合亚洲欧美另类图片| 六月丁香七月| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 99热这里只有是精品50| 成人欧美大片| 三级国产精品欧美在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久久久九九精品影院| 一本精品99久久精品77| 小说图片视频综合网站| 色综合亚洲欧美另类图片| 男女视频在线观看网站免费| 国产精品久久电影中文字幕| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产精品精品国产色婷婷| 热99re8久久精品国产| 一级毛片aaaaaa免费看小| 一区二区三区高清视频在线| 欧美精品国产亚洲| 1024手机看黄色片| 国产av麻豆久久久久久久| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲熟妇熟女久久| 成人性生交大片免费视频hd| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产精品,欧美在线| 俺也久久电影网| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 精品午夜福利在线看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 黄色欧美视频在线观看| 九九在线视频观看精品| 亚洲av免费在线观看| 简卡轻食公司| 国产精品亚洲美女久久久| 国产一区二区三区av在线 | 99久久精品国产国产毛片| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 免费大片18禁| av黄色大香蕉| 日韩人妻高清精品专区| 免费大片18禁| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲av不卡在线观看| 全区人妻精品视频| 九九热线精品视视频播放| 国产精品久久久久久久久免| 在线观看免费视频日本深夜| 麻豆国产97在线/欧美| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产老妇女一区| a级毛片免费高清观看在线播放| 日韩 亚洲 欧美在线| 色5月婷婷丁香| 国产精品av视频在线免费观看| 禁无遮挡网站| 中国美白少妇内射xxxbb| 婷婷六月久久综合丁香| 国产精品一区www在线观看| 成人永久免费在线观看视频| www.色视频.com| 熟女人妻精品中文字幕| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 久久久久久久久大av| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美潮喷喷水| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲精品国产av成人精品 | 亚洲国产欧洲综合997久久,| 久久人人爽人人片av| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲自偷自拍三级| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产精品国产高清国产av| 国产伦精品一区二区三区视频9| 好男人在线观看高清免费视频| 国产成人一区二区在线| 婷婷六月久久综合丁香| 一级毛片久久久久久久久女| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 22中文网久久字幕| 黄色视频,在线免费观看| 校园春色视频在线观看| 亚洲成人av在线免费| 一级毛片电影观看 | 91久久精品电影网| 日日干狠狠操夜夜爽| 级片在线观看| 中文字幕av成人在线电影| 在线观看一区二区三区| 亚洲av免费高清在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 日韩制服骚丝袜av| 熟女人妻精品中文字幕| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲熟妇熟女久久| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产免费一级a男人的天堂| 91在线精品国自产拍蜜月| 日本一本二区三区精品| 国产一区二区三区av在线 | 午夜爱爱视频在线播放| 黄色配什么色好看| 亚洲内射少妇av| 亚洲人成网站在线播| 欧美+亚洲+日韩+国产| 精品久久久久久久末码| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲美女视频黄频| 人妻少妇偷人精品九色| 婷婷亚洲欧美| 欧美一区二区国产精品久久精品| 久久精品国产亚洲av天美| 男女啪啪激烈高潮av片| 嫩草影院入口| 国产精品人妻久久久久久| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 成人亚洲欧美一区二区av| 最近视频中文字幕2019在线8| 直男gayav资源| 国产一区二区三区av在线 | 欧美高清性xxxxhd video| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美色视频一区免费| 身体一侧抽搐| 91av网一区二区| av女优亚洲男人天堂| 高清午夜精品一区二区三区 | 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲人成网站高清观看| 一级a爱片免费观看的视频| 国产中年淑女户外野战色| 成人特级黄色片久久久久久久| 免费搜索国产男女视频| 日韩欧美国产在线观看| 伦理电影大哥的女人| 午夜影院日韩av| 日本精品一区二区三区蜜桃| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产69精品久久久久777片| 看片在线看免费视频| 欧美区成人在线视频| 国产不卡一卡二| 偷拍熟女少妇极品色| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 赤兔流量卡办理| 国产乱人视频| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲欧美日韩高清专用| 天堂网av新在线| 国产成人精品久久久久久| 免费av毛片视频| 在线观看午夜福利视频| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 午夜福利18| 久久久精品欧美日韩精品| 久久午夜亚洲精品久久| 国产高清三级在线| 成年版毛片免费区| avwww免费| 狠狠狠狠99中文字幕| 桃色一区二区三区在线观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产免费一级a男人的天堂| 五月玫瑰六月丁香| 禁无遮挡网站| 黄色欧美视频在线观看| 国内精品美女久久久久久| 亚州av有码| 日韩亚洲欧美综合| 国产精品一区二区免费欧美| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 日韩中字成人| 免费搜索国产男女视频| 在线播放国产精品三级| 看十八女毛片水多多多| 香蕉av资源在线| 亚洲欧美清纯卡通| 成人美女网站在线观看视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产精品久久久久久精品电影| 男人的好看免费观看在线视频| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产免费男女视频| 日韩欧美 国产精品| 哪里可以看免费的av片| 熟女人妻精品中文字幕| 国产精品电影一区二区三区| 日韩一本色道免费dvd| 一级毛片久久久久久久久女| 午夜福利成人在线免费观看| 大香蕉久久网| 免费av毛片视频| 99在线人妻在线中文字幕| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久久久久久久久久丰满| 少妇被粗大猛烈的视频| 简卡轻食公司| 亚洲无线观看免费| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 少妇的逼好多水| 国产淫片久久久久久久久| 日韩一区二区视频免费看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 又爽又黄无遮挡网站| 国产精品99久久久久久久久| 深夜a级毛片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 久久草成人影院| 亚洲色图av天堂| 亚洲综合色惰| 日韩高清综合在线| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产不卡一卡二| 男插女下体视频免费在线播放| 国产成人a区在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 偷拍熟女少妇极品色| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 久久鲁丝午夜福利片| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲国产色片| 国产免费男女视频| 热99在线观看视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 99久久精品一区二区三区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产精品久久久久久av不卡| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久热精品热| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产精品伦人一区二区| 精品福利观看| 国产高清视频在线观看网站| 99热6这里只有精品| 亚洲性久久影院| 少妇丰满av| 久久国内精品自在自线图片| 色5月婷婷丁香| 97超视频在线观看视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产高清不卡午夜福利| 男女边吃奶边做爰视频| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲成人久久性| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲av不卡在线观看| 99视频精品全部免费 在线| 久久人人爽人人爽人人片va| 一级黄片播放器| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲自偷自拍三级| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲经典国产精华液单| 国产精品三级大全| 又爽又黄无遮挡网站| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲国产欧美人成| 欧美中文日本在线观看视频| 大香蕉久久网| 国产成年人精品一区二区| aaaaa片日本免费| h日本视频在线播放| 国产精品三级大全| 国产精品久久电影中文字幕| 精品熟女少妇av免费看| а√天堂www在线а√下载| 淫妇啪啪啪对白视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 大香蕉久久网| 我要看日韩黄色一级片| 国产精品永久免费网站| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产精品三级大全| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲av免费高清在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 天堂动漫精品| 成年av动漫网址| 婷婷精品国产亚洲av在线| 成人午夜高清在线视频| 99精品在免费线老司机午夜| 精华霜和精华液先用哪个| 毛片女人毛片| 国产精品乱码一区二三区的特点| 免费高清视频大片| 91精品国产九色| 我的老师免费观看完整版| 国产成人影院久久av| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 我的女老师完整版在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 色综合站精品国产| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 日韩欧美精品v在线| 插阴视频在线观看视频| 国产午夜精品论理片| 黑人高潮一二区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 不卡一级毛片| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 啦啦啦韩国在线观看视频| 看非洲黑人一级黄片| 免费在线观看成人毛片| 久久久久久九九精品二区国产| 91久久精品国产一区二区成人| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 日本 av在线| 欧美3d第一页| 悠悠久久av| 午夜福利在线观看吧| 中文字幕av在线有码专区| 精品乱码久久久久久99久播| 色视频www国产| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲国产色片| 欧美三级亚洲精品| 久久午夜福利片| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 黑人高潮一二区| av在线老鸭窝| 国产成人91sexporn| 日本三级黄在线观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 久久精品夜色国产| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 在现免费观看毛片| 日本成人三级电影网站| 亚洲国产精品成人综合色| 欧美激情国产日韩精品一区| 麻豆国产97在线/欧美| 观看免费一级毛片| 深夜精品福利| 观看免费一级毛片| 亚洲av.av天堂| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲av.av天堂| 国产 一区 欧美 日韩|