活性干酵母活化時間與級數(shù)對葡萄酒發(fā)酵的影響

劉嘉璐，孫玉梅*，黃 超，唐文竹

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

在葡萄酒的釀造過程中，釀酒酵母主導(dǎo)著整個生物轉(zhuǎn)化過程。葡萄汁中的糖分通過釀酒酵母的代謝作用，轉(zhuǎn)化成酒精、有機(jī)酸以及各種風(fēng)味物質(zhì)[1]。

在工業(yè)生產(chǎn)中，為了避免擴(kuò)大培養(yǎng)酵母，通常采用活性干酵母。由于活性干酵母細(xì)胞內(nèi)含水量低（＜6%）[2]，需要活化后使用[3]。選擇合適的釀酒酵母酵母活化條件，可以有效提高釀酒酵母的活性[4-5]。干酵母于36～40℃無菌水中活化15 min，即可接種到發(fā)酵罐中[6]。也可以將活性干酵母在20倍（質(zhì)量比）含糖5%的溫水（35～40℃）中分散均勻，活化20～30 min[7]。王傳榮[8]研究的安琪耐高溫酒精活性干酵母（temperature tolerant Angel active dry yeast，TH-AADY）復(fù)水溫度為35～40℃，時間為10～15 min，活化溫度為35℃，活化時間為60 min。SCHMIDT S A等[9]把活性干酵母在35～43℃復(fù)水活化15 min，即可以使細(xì)胞的活力恢復(fù)到最佳的狀態(tài)。KONTKANE D等[10]將活性干酵母進(jìn)行3 h 15 min的糖度（10°Bx、20°Bx）和溫度（40℃、25℃、20℃）梯度馴化，接種發(fā)酵后的酵母生物量、耗糖、產(chǎn)酒精明顯高于不馴化直接接種方式。酵母的不同活化方式可以有效避免由于酵母的大量失活而導(dǎo)致起酵緩慢、發(fā)酵停滯等問題。為了加快葡萄汁酒精發(fā)酵的啟動，或者葡萄汁存在發(fā)酵不徹底的危險，可以在24 h前制備母液[7]。對于不同的酵母種類、發(fā)酵溫度，通用的活化方式不一定可以有效提高酵母活性，而同一活化時間不同的活化級數(shù)也可能對酵母活性與葡萄酒發(fā)酵有影響。

本研究通過檢測發(fā)酵過程中酵母的活細(xì)胞濃度和總菌體濃度、二氧化碳生成量和耗糖量以及乙醇和乙酸產(chǎn)量，探究用于葡萄酒釀造的活性干酵母LV的活化時間和活化級數(shù)對葡萄酒發(fā)酵的影響，以期活性干酵母在葡萄酒發(fā)酵過程中有較好的生長和代謝狀態(tài)，控制其活化條件對其活性的提高和葡萄酒發(fā)酵有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

活性干酵母LV：遼寧本溪桓仁五女山米蘭酒業(yè)有限公司；24°Bx普通葡萄模擬汁：根據(jù)葡萄的成分組成[11]以及參考文獻(xiàn)[12-15]配制。

葡萄糖、果糖：山東西王藥業(yè)有限公司；酵母浸粉：北京奧博星生物試劑有限公司；多種氨基酸（色氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、賴氨酸、絲氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸）：上海阿拉丁生化科技有限公司。乙醇（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸（分析純）：天津市恒興化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C型精密pH計(jì)、722S型分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HITACHI CR21 GⅢ離心機(jī)：日本日立工機(jī)株式會社；ZHJH-C2109B超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；GC8900氣相色譜儀：山東經(jīng)緯分析儀器有限公司；FFAP色譜柱（30 m×0.32 mm×0.5 μm）：大連三杰科技發(fā)展有限公司；N2000色譜工作站：浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司；SPME 57330-U萃取手柄、SPME 65 μm PDMS/DVB萃取纖維頭：美國SUPELCO有限公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒酵母的活化

本研究對LV活性干酵母進(jìn)行（25 min、3 h 15 min和24 h 15 min）三種活化時間，其中3 h 15 min活化分為兩級和三級并同時采用不同糖度的活化，詳見表1?；罨蠼臃N到24°Bx葡萄模擬汁中，于24℃控溫發(fā)酵。

表1 LV活性干酵母的活化方式Table 1 Activation methods of LV active dry yeast

1.3.2 葡萄酒釀造工藝流程

配制模擬葡萄汁→分裝模擬葡萄汁（500 mL/瓶）→接種酵母菌種子液→24℃控溫發(fā)酵→終止發(fā)酵

操作要點(diǎn)：無機(jī)鹽、維生素和氨基酸分別制成母液備用，再與其他試劑混合均勻后配制模擬葡萄汁分裝使用（為了保持實(shí)驗(yàn)的一致性，因此自行配制模擬葡萄汁而不采用天然葡萄汁）。發(fā)酵體系為1 L三角瓶，每個三角瓶分別裝入500 mL普通葡萄模擬汁?；钚愿山湍附臃N量為0.25 g/L，經(jīng)不同方式活化（酵母濃度為2.8×109個/mL）后接種16 mL到500 mL葡萄汁中進(jìn)行24℃控溫發(fā)酵。發(fā)酵前2 d用棉塞封瓶口。當(dāng)發(fā)酵液中有氣體產(chǎn)生時，把棉塞換為發(fā)酵栓，每個發(fā)酵栓中加滅菌水8 mL，開始厭氧發(fā)酵。在發(fā)酵液中的還原糖量降至不變時，終止發(fā)酵。發(fā)酵初期為第0～4天，發(fā)酵中期為第5～10天，發(fā)酵后期為第11～18天。

模擬葡萄汁參考普通葡萄汁的化合物含量，無機(jī)鹽、維生素與氨基酸分別制成母液備用（見表2）。每種活化分別設(shè)置2個平行。

表2 模擬普通葡萄汁的配方[11]Table 2 Formula of normal synthetic grape juice

1.3.3 樣品的取樣及處理

發(fā)酵過程中，活酵母菌濃度與總菌體濃度在第0、1、2、4、7、11、14、18天取樣（3 mL）測定；CO2生成量每天測定；還原糖含量在第1、2、4、7、11、18天取樣（1 mL）測定；乙醇和乙酸含量在第0、2、4、7、13、18天取樣（21 mL）測定，樣品保存于-20℃冰箱中。

測定各理化指標(biāo)前，于4℃冰箱中解凍。其中還原糖、乙醇和乙酸的樣品需要離心（10 000 r/min、4℃、10 min）得發(fā)酵上清液。

1.3.4 活酵母菌濃度測定

發(fā)酵液樣品用呂氏堿性美藍(lán)染色，在顯微鏡下計(jì)活酵母菌數(shù)（活酵母不被染色，死亡的酵母被染成藍(lán)色）[16]。

1.3.5 菌體密度的檢測

適量稀釋樣品后，分光光度計(jì)在波長600 nm處檢測吸光度值OD600nm。

1.3.6 還原糖含量測定

采用 3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法測定還原糖含量[17]。

1.3.7 CO2生成量測定

發(fā)酵開始后，每天固定時間稱取發(fā)酵瓶的質(zhì)量。從培養(yǎng)箱取出的發(fā)酵瓶放入搖床，于100 r/min搖動5 min。待氣泡消失后，用電子天平測量發(fā)酵瓶質(zhì)量。通過前后兩次稱質(zhì)量的差值來反映CO2生成量。如需取出發(fā)酵液樣品，需要測量取樣前后發(fā)酵瓶的質(zhì)量[18]。

1.3.8 乙醇和乙酸的測定

采用頂空-固相微萃取-氣相色譜法（headspace solid phase microextraction-gas chromatography，HS-SPME-GC）檢測樣品中乙醇和乙酸的含量。

固相微萃取條件：向20 mL頂空瓶中加入7 mL樣品，1.4 g NaCl和磁力攪拌轉(zhuǎn)子，加蓋密封。49℃水浴加熱，攪拌速率250 r/min，平衡時間10 min，然后插入萃取纖維頭（65 μm PDMS/DVB、SUPELCO），萃取時間為45 min。萃取完成后，將纖維頭插入氣相色譜汽化室，解吸5 min。

氣相色譜條件：FFAP毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.5 μm）；汽化室溫度250℃，火焰離子檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）溫度 250℃，色譜柱初始溫度40℃，保持3 min，以1.5℃/min速率升溫至46℃，保持2 min，以6℃/min速率升溫至52℃，保持3 min，以5℃/min速率升溫至190℃，保持2 min；空氣流量300 mL/min，氫氣流量30mL/min，載氣為氮?dú)猓∟2），流量 30mL/min，分流比10∶1。

2 結(jié)果與分析

2.1 活化時間對葡萄酒發(fā)酵的影響

2.1.1 活化時間對發(fā)酵過程中活酵母菌濃度與總菌體濃度的影響

不同的活化時間對發(fā)酵過程中LV干酵母活菌濃度及總菌體濃度的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，雖然3種活化時間的酵母在發(fā)酵過程中總菌體濃度沒有較大差異（P＞0.05），但是活酵母菌濃度差異較大（P＜0.05）。在發(fā)酵初期，各種活化實(shí)驗(yàn)組的活酵母菌數(shù)量呈上升趨勢?；罨?h 15min的活酵母菌濃度高于另外兩組（P＜0.05），在發(fā)酵中期仍處于增長狀態(tài)，最高達(dá)到4.23×107個/mL；活化24 h 15 min的活酵母菌濃度略低；活化25 min的酵母在發(fā)酵中期活酵母菌濃度最早（第10天）開始下降。

圖1 不同活化時間的LV干酵母在發(fā)酵過程中活酵母菌濃度(A)及菌體總濃度(B)的變化Fig.1 Changes of viable yeast concentration(A)and total yeast concentration(B)during fermentation by LV dry yeast with different activation time

由此可見，活化3 h 15 min可以使酵母在發(fā)酵初期快速生長繁殖，擁有較高的活性。說明較長時間的活化，有利于酵母充分地適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，并維持生長活力，表現(xiàn)為較長時間和較大量的細(xì)胞生長。而過長時間的活化可能會使酵母在種子液中因營養(yǎng)耗盡而活力下降，短時間活化不利于酵母在發(fā)酵過程中維持較長時間的生長活性。

2.1.2 活化時間對發(fā)酵過程中還原糖含量的影響

不同的活化時間對發(fā)酵過程中還原糖含量的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，在發(fā)酵初期，即發(fā)酵第2天檢測的活化3h15min和24h15 min的酵母還原糖含量分別為98.95 g/L和111.26 g/L，結(jié)果表明，活化3 h 15 min的酵母發(fā)酵消耗的還原糖較多，活化24h15min的酵母其次。這與不同時間活化的酵母在發(fā)酵初期的活酵母菌濃度及總菌體濃度的差異一致。在發(fā)酵第7天檢測還原糖含量根據(jù)發(fā)酵時間由短到長分別為66.06 g/L、40.93 g/L、53.17 g/L，表明活化25 min的酵母耗糖最慢。

圖2 不同活化時間的LV干酵母在發(fā)酵過程中還原糖含量的變化Fig.2 Changes of reducing sugar contents during fermentation by LV dry yeast with different activation time

由此可見，較長時間活化可以使酵母快速適應(yīng)環(huán)境，較快和較多地生長繁殖，并維持較高的發(fā)酵活力。而過長或過短時間的活化會使酵母生長和發(fā)酵活力較低。

2.1.3 活化時間對發(fā)酵過程中CO2生成量的影響

不同的活化時間對發(fā)酵過程中CO2生成量的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨發(fā)酵時間的延長，CO2生成量逐漸增加，發(fā)酵初期升高較快，發(fā)酵中期和后期升高較慢，到12 d后CO2的生成量基本不變，活化時間由短到長CO2的生成量依次為90.29 g/L、77.27 g/L和86.42 g/L。發(fā)酵中期和后期的各組CO2生成量差異明顯（P＜0.05），活化25 min的酵母發(fā)酵CO2生成量最多，為91.2 g/L；活化3 h 15 min的酵母CO2生成量最少，為78.35 g/L。

圖3 不同活化時間的LV干酵母在發(fā)酵過程中的CO2生成量變化Fig.3 Changes of CO2production during fermentation by LV dry yeast with different activation time

CO2的生成量差異可以體現(xiàn)出發(fā)酵過程中的酵母活性的差異[17]，活化3 h 15 min的酵母CO2生成量較低，可能是因?yàn)榧?xì)胞生長能力較強(qiáng)，所以發(fā)酵性能較高。而活化過長或過短時間的酵母CO2的生成量較高，圖1也顯示了相應(yīng)活化時間的酵母生長量較少，可能在葡萄酒發(fā)酵中較多的CO2抑制了釀酒酵母的生長[19]，并降低了細(xì)胞活性，比如活化25 min的酵母在發(fā)酵中期活酵母菌濃度最早（第10天）開始下降。結(jié)果表明，CO2生成量的差異與活化不同時間的酵母在發(fā)酵過程中還原糖含量的差異一致。

2.1.4 活化時間對發(fā)酵過程中乙醇和乙酸含量的影響

不同活化對發(fā)酵過程中乙醇和乙酸含量的影響結(jié)果見圖4。由圖4A可知，活化3 h 15 min的酵母在整個發(fā)酵過程中乙醇產(chǎn)量均高于另外兩種活化時間的酵母。在發(fā)酵初期，活化24 h 15 min與活化25 min的酵母乙醇產(chǎn)量無明顯差異（P＞0.05）；在發(fā)酵中期和后期，即在發(fā)酵第10天和第18天的檢測結(jié)果表明，活化24h15min的酵母乙醇產(chǎn)量分別為38.54g/L和56.59 g/L，均高于活化25 min的酵母乙醇產(chǎn)量，為32.66 g/L和46.5 g/L。在發(fā)酵第15～18天實(shí)驗(yàn)組乙醇的積累基本達(dá)到穩(wěn)定。發(fā)酵終止時，活化3 h 15 min的釀酒酵母乙醇積累量較多（60.4 g/L），明顯高于25 min活化的方式，略高于24 h 15 min活化方式（56.59 g/L）。由此可見，較長時間活化可以提高酵母乙醇發(fā)酵活性。由圖4B可知，在發(fā)酵過程中，3種活化時間的酵母在發(fā)酵過程中的乙酸產(chǎn)生量逐漸增多，發(fā)酵14 d后的乙酸生成速率減小，隨酵母活化時間的延長最終乙酸產(chǎn)量依次增加（P＜0.05）。乙酸是酒精發(fā)酵的副產(chǎn)物，一般控制普通葡萄酒中乙酸含量低于1.2 g/L[20]。3種活化時間的酵母，乙酸的產(chǎn)量都能滿足葡萄酒發(fā)酵控制乙酸生成量的要求，為保證葡萄酒質(zhì)量，不宜過長時間活化酵母。

圖4 不同活化時間的LV干酵母在發(fā)酵過程中乙醇(A)和乙酸(B)含量的變化Fig.4 Changes of ethanol(A)and acetic acid(B)contents during fermentation by LV dry yeast with different activation time

2.2 活化級數(shù)對葡萄酒發(fā)酵的影響

2.2.1 活化級數(shù)對發(fā)酵過程中活酵母菌濃度與總菌體濃度的影響

不同的活化級數(shù)對發(fā)酵過程中LV干酵母活菌濃度及總菌體濃度的影響結(jié)果見圖5。由圖5A可知，三級活化的酵母在發(fā)酵初期的酵母活菌濃度高于二級活化的酵母，達(dá)到4.51×107個/mL。在發(fā)酵第11天，二級活化的酵母活菌濃度達(dá)到最大值，為4.43×107個/mL。由圖5B可知，在發(fā)酵前2 d，菌體總濃度的差異不明顯（P＞0.05）。在發(fā)酵中期和后期，三級活化的酵母菌體總濃度基本高于二級活化（P＜0.05）。在發(fā)酵后期，三級活化的酵母活菌濃度基本高于二級活化（P＜0.05）。

圖5 不同活化級數(shù)的LV干酵母在發(fā)酵過程中活酵母菌濃度(A)及總菌濃度(B)的變化Fig.5 Changes of viable yeast concentration(A)and total yeast concentration(B)during fermentation by LV dry yeast with different activation stages

由此可見，三級活化的酵母在發(fā)酵過程中的活酵母菌濃度基本高于二級，總菌體濃度在發(fā)酵中期和后期均處于較高的狀態(tài)。因此，不同的活化級數(shù)對于在發(fā)酵過程中活酵母菌濃度和總菌濃度具有顯著影響（P＜0.05）。

2.2.2 活化級數(shù)對發(fā)酵過程中還原糖含量的影響

不同的活化級數(shù)對發(fā)酵過程中還原糖含量的影響結(jié)果見圖6。由圖6可知，在發(fā)酵初期，兩種級數(shù)活化的酵母發(fā)酵消耗還原糖差異不明顯（P＞0.05），發(fā)酵第2天檢測二級與三級活化的酵母還原糖含量分別為214.1 g/L和218.24 g/L。到了發(fā)酵中期，消耗的還原糖含量差異顯著（P＜0.05），第7天檢測三級活化的酵母還原糖含量為31.96 g/L，二級活化的酵母還原糖含量為40.93 g/L，可知三級活化的酵母消耗還原糖的能力高于二級。最終，在14～18 d還原糖含量逐漸降為0。由此可見，不同級數(shù)活化的酵母在發(fā)酵中期消耗還原糖的含量差異顯著（P＜0.05）。

圖6 不同活化級數(shù)的LV干酵母在發(fā)酵過程中還原糖含量的變化Fig.6 Changes of reducing sugar contents during fermentation by LV dry yeast with different activation stages

2.2.3 活化級數(shù)對發(fā)酵過程中CO2生成量的影響

不同的活化級數(shù)對發(fā)酵過程中CO2生成量的影響結(jié)果見圖7。由圖7可知，不同活化級數(shù)的酵母在發(fā)酵過程中CO2生成量無明顯差異。由此可見，活化級數(shù)對酵母發(fā)酵過程中CO2生成量無顯著影響（P＞0.05）。

圖7 不同活化級數(shù)的LV干酵母在發(fā)酵過程中的CO2生成量變化Fig.7 Changes of CO2production during fermentation by LV dry yeast with different activation stages

2.2.4 活化級數(shù)對發(fā)酵過程中乙醇和乙酸含量的影響

由圖8A可知，在發(fā)酵初期和中期，即發(fā)酵第4天和第10天檢測乙醇，三級活化的酵母乙醇的產(chǎn)量（30.47 g/L和48.65g/L）均顯著高于二級（26.69g/L和46.33g/L）（P＜0.05）。而至發(fā)酵后期，二者乙醇的積累量相差不大（P＞0.05）。由此可見，兩種不同級數(shù)活化的酵母在發(fā)酵初期和中期對乙醇的產(chǎn)量的影響較為顯著（P＜0.05），但最終乙醇的積累無顯著差異（P＞0.05）。

由圖8B可知，兩種活化級數(shù)的酵母在發(fā)酵前期乙酸產(chǎn)量有顯著差異（P＜0.05），在發(fā)酵第4天檢測乙酸含量，三級活化的酵母乙酸產(chǎn)量高于二級，分別為0.35 g/L和0.32 g/L。但在發(fā)酵中期和后期無顯著差異（P＞0.05）。最終乙酸的產(chǎn)量均＜1.2 g/L。

圖8 不同活化級數(shù)的LV干酵母在發(fā)酵過程中乙醇(A)和乙酸(B)含量的變化Fig.8 Changes of ethanol(A)and acetic acid(B)contents during fermentation by LV dry yeast with different activation stages

3 結(jié)論

通過不同的活化時間和級數(shù)活化活性干酵母LV，接種到模擬葡萄汁進(jìn)行葡萄酒發(fā)酵。結(jié)果表明活化時間和級數(shù)對釀酒酵母生長及發(fā)酵能力有較大影響?；罨?h15min比活化24 h 15 min和25 min的酵母生長代謝能力強(qiáng)，酵母活菌濃度達(dá)到4.23×107個/mL；耗糖快；產(chǎn)乙醇較多，在發(fā)酵18 d后達(dá)到60.4 g/L。進(jìn)行三級3 h 15 min活化活酵母菌濃度較大，最高達(dá)到4.51×107個/mL；兩種級數(shù)活化的酵母在發(fā)酵過程中還原糖含量差異顯著（P＜0.05），CO2生成量、乙醇和乙酸沒有顯著差異（P＞0.05）。如果在工業(yè)生產(chǎn)中對酵母的含量活性要求較高，建議采用3 h 15 min三級活化的方式。