臍血造血干細(xì)胞分離方法的實驗研究

王永娟

摘 要：臍血作為一種造血干細(xì)胞來源可替代骨髓進(jìn)行造血干細(xì)胞移植， 臍血移植在治療兒童遺傳性疾病和血液病方面取得了巨大的成效。為進(jìn)一步推廣臍血移植，必須相應(yīng)地建立起完備的臍血庫。臍血庫不同于骨髓庫， 它必須凍存實物。為減少凍存體積， 降低成本， 需要采取有效的方法分離臍血中有核細(xì)胞， 從而使大規(guī)模、廣泛地建立臍血庫成為可能。本文對臍血造血干細(xì)胞分離進(jìn)行實驗研究分析。

引言

臍帶血（umbilical cord blood，UCB） 是產(chǎn)后留存在胎盤和臍帶中的血液， 以往被作為醫(yī)學(xué)廢物而丟棄。近十幾年的研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶中存在大量間充質(zhì)干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal sterncells，MSCs）是成體干細(xì)胞的一種，具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能， 可以重建人體造血和免疫系統(tǒng)的造血干/祖細(xì)胞， 可用于造血干細(xì)胞移植，治療多種疾病。

一、試驗方法

1.1臍帶血造血干細(xì)胞分離

利用離心沉降法和自然沉降法分離臍帶血有核細(xì)胞，計算有核細(xì)胞回收率和紅細(xì)胞回收率，比較兩種分離方法的分離效果。

離心沉降法：將6%的羥乙基淀粉注射液和臍帶血按照1∶5的比例混合，慢速搖勻10min，以50g、10℃離心7min，收集上層富白細(xì)胞血漿，再以400g、10℃離心15min，去除血漿。

自然沉降法：將6%的羥乙基淀粉注射液和臍帶血按照1：5的比例混合，慢速搖勻10min，懸掛讓其內(nèi)細(xì)胞自然沉降1h后，收集上層富白細(xì)胞血漿，同樣以400g、10℃離心15min，去除血漿。

1.2臍帶血造血干細(xì)胞凍存

將分離后的臍帶血分別與4種不同的冷凍保護(hù)劑混合，臍帶血與冷凍保護(hù)劑的體積比為4∶1，混合時應(yīng)將冷凍保護(hù)劑緩慢注入臍帶血中，邊注入邊晃動。用程控降溫儀按以下程序降溫，4℃保持10min，以-1℃/min的速率降溫至-40℃，再以-10℃/min的速率降溫至-80℃，完成后將臍帶血混合物放入液氮罐中儲存。4種冷凍保護(hù)劑分別為：DMSO和0.9%氯化鈉溶液1∶1混合液，DMSO和6%右旋糖酐1∶1混合液，DMSO和6%羥乙基淀粉1∶1混合液，DMSO、胎牛血清和F12培養(yǎng)基9∶4∶5混合液。冷凍保護(hù)劑新鮮配制并于4℃提前預(yù)冷。

1.3凍存后復(fù)蘇

臍帶血凍存3個月后，將凍存的臍帶血在37℃水浴鍋中復(fù)蘇，測細(xì)胞存活率，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行造血干細(xì)胞表面標(biāo)志等分析，并進(jìn)行祖細(xì)胞集落培養(yǎng)，從而比較4種冷凍保護(hù)劑的凍存效果的差異性。

1.4存活率檢測

取100μL臍帶血樣品，加入900μL氯化銨溶血素，4℃避光反應(yīng)5min，200g離心5min，棄上清加入細(xì)胞重懸液900μL重懸，再取50μL混合液加入臺盼藍(lán)2X溶液50μL，靜置3min后計數(shù)。每個樣品至少數(shù)300個細(xì)胞，計算有核細(xì)胞存活率。

1.5流式細(xì)胞儀檢測

計數(shù)CD34+細(xì)胞是檢驗造血干細(xì)胞活性的公認(rèn)方法之一。取50μL臍帶血樣品，加入小鼠抗人CD34-PE、CD45-FITC抗體各10μL，室溫避光孵育20min，然后加入300μL溶血素避光反應(yīng)15min，最后加入300μL鞘液避光靜置3min，待流式細(xì)胞儀檢測。

1.6祖細(xì)胞集落培養(yǎng)

集落形成分析是一種檢驗造血干祖細(xì)胞活性公認(rèn)的敏感方法。取100μL臍帶血樣品，加入900μL氯化銨溶血素，4℃避光反應(yīng)5min，200g離心5min，棄上清后加入1mLIMDM洗滌2次，加入200μLIMDM重懸，取適量細(xì)胞加入甲基纖維素培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中細(xì)胞終濃度1×105cells/mL，混勻培養(yǎng)基后平分為2份加入到24孔培養(yǎng)板中，于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12d后分別對CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E進(jìn)行計數(shù)統(tǒng)計。

1.7凍存時間對臍帶血造血干細(xì)胞的影響

選擇上述研究中最佳冷凍保護(hù)劑，采用相同的試劑和方法，比較同一份臍帶血樣本凍存前、凍存3個月、6個月和一年的存活率、有核細(xì)胞數(shù)、CD34+造血干細(xì)胞數(shù)、祖細(xì)胞集落數(shù)。

1.8統(tǒng)計方法

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，測定結(jié)果均按平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計學(xué)處理采用區(qū)組設(shè)計的方差分析，顯著性水平為P<0.05。

二、試驗結(jié)果

2.1有核細(xì)胞分離效果

離心沉降法有核細(xì)胞回收率為83.60%±9.44%，自然沉降法有核細(xì)胞回收率為86.40%±8.49%，二者之間差異無顯著性意義（P>0.05），但離心沉降法所需時間更短，操作簡便，更適合臍帶血庫。

2.2復(fù)蘇后有核細(xì)胞回收率和存活率

4種凍存液凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后有核細(xì)胞回收率和存活率結(jié)果見表1。結(jié)果表明：第4種冷凍保護(hù)劑凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后有核細(xì)胞回收率與前3種的差異有極顯著意義（P<0.01），且數(shù)據(jù)偏低不能達(dá)到要求；第1，2，3種冷凍保護(hù)劑復(fù)蘇有核細(xì)胞回收率的差異無顯著意義（P>0.05）；4種冷凍保護(hù)劑復(fù)蘇細(xì)胞存活率的差異有極顯著意義（P<0.01），其中第2種和第3種差異不顯著，復(fù)蘇后存活率最佳。

2.3復(fù)蘇后流式分析和祖細(xì)胞培養(yǎng)

4種冷凍保護(hù)劑凍存的細(xì)胞復(fù)蘇流式分析和祖細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果見表2。4種冷凍保護(hù)劑冷凍的細(xì)胞復(fù)蘇CD34+回收率和祖細(xì)胞回收率的差異均有極顯著意義（P<0.01），其中第2種和第3種差異不顯著，流式CD34+和祖細(xì)胞回收率最高。

三、結(jié)果與討論

分離臍帶血造血干細(xì)胞方法常采用分選法、羥乙基淀粉沉淀法和密度梯度離心法。由于目的不同，各類方法有其自身特點(diǎn)。分選法使用磁珠或流式細(xì)胞配合相應(yīng)單克隆抗體分離得到較純的細(xì)胞群體，但細(xì)胞回收率較低，且成本昂貴，適合對細(xì)胞純度要求較高的研究； 密度梯度離心法多采用Percoll、Ficoll 分離液分離細(xì)胞，得到單個核細(xì)胞群，但純度不高； 羥乙基淀粉沉淀法，分離的細(xì)胞量大、成分較多但紅細(xì)胞含量高，適合臍帶血庫等用于大量分離儲存干細(xì)胞。本研究對臍帶血庫常用的羥乙基淀粉自然沉降法和離心沉降法的有核細(xì)胞回收率進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示兩種方法差異無統(tǒng)計學(xué)意義，離心沉降法效率更高。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉獻(xiàn)志，劉紫輝，楊波.臍血造血干細(xì)胞分離方法的實驗研究[J].醫(yī)藥論壇雜志，2007（05）：52-54.