透射電子顯微鏡在生物大分子結(jié)構(gòu)與功能研究中的應(yīng)用

梁昂昂

摘 要：透射電子顯微鏡的基本原理和主要的兩種樣品制備方法，冷凍電鏡技術(shù)和負(fù)染色技術(shù)。

關(guān)鍵詞：TEM ，CRYO-EM ，NS-EM

1932年德國科學(xué)家Ruska研制出以電子束作為光源的透射電子顯微鏡，得益于電子顯微鏡遠(yuǎn)高于光學(xué)顯微鏡的分辨能力，人類第一次看到細(xì)胞及其內(nèi)部器官的細(xì)節(jié)，病毒的結(jié)構(gòu)。隨著對生物體微觀結(jié)構(gòu)的探索，電子顯微鏡也隨之顯示出巨大的潛力。

迄今為止，電子顯微鏡獲得的三維信息仍然依賴于物體的透射二維圖像，即通過得到大量從不同角度獲取的投影，從而重建物體的三維結(jié)構(gòu)信息。

（一）透射電子顯微鏡成像原理

簡單地說，透射電子顯微鏡是以電子束作為照明光源的顯微鏡，其實質(zhì)是通過外部電磁場作用使電子束產(chǎn)生彎曲，從而形成電子束“透鏡”。由于經(jīng)過高電壓加速的電子波長很短，所以電子顯微鏡的分辨率要大大高于傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡。事實上，現(xiàn)代電子顯微鏡的分辨率已經(jīng)達(dá)到了1？的水平（但是相較于電子的波長，電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)仍然有很大的潛力）。

一般來說，透射電子顯微鏡的工作原理是：由電子槍發(fā)射出電子束，經(jīng)過被抽成高真空狀態(tài)的鏡腔通道中，沿光軸方向通過聚光鏡，然后電子束會聚成一束很細(xì)且亮度均勻的光斑，照射在放置于樣品室內(nèi)的樣品上；入射電子與樣品會發(fā)生各種各樣的相互作用，除了直接透過的電子，其他電子將會和樣品內(nèi)部原子發(fā)生相互作用而被散射，因為不同的原子和不同的作用距離會影響電子的空間出射角度，因此透過樣品后的電子束將攜帶樣品內(nèi)部的結(jié)構(gòu)信息；然后通過物鏡的會聚調(diào)焦，且應(yīng)用光闌把將彈性散射電子阻擋后，電子束被初級放大，然后進(jìn)入下級中間透鏡并和投影鏡系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步的放大成像，最后將被放大了的電子影像投射在觀察室內(nèi)的熒光屏上，供使用者觀察，并可被CCD記錄。

在電子顯微鏡成像過程中，由于電子顯微鏡中各器件的影響，從傅立葉空間中看，樣品的振幅和相位信息將被電子顯微鏡調(diào)制，從而在成像過程中附加儀器信息。這些額外的信息可以通過所謂的襯度傳遞函數(shù)（CTF）來表示，其主要參數(shù)包括電鏡的球差系數(shù)，電子的波長，欠焦值和頻率值等，其形狀類似隨頻率而變化的正弦波。再加上由于電子束干涉質(zhì)量、能量擴(kuò)散、色差、電流和電壓不穩(wěn)定引起的頻率衰減效應(yīng)，導(dǎo)致頻譜空間將有一個類似衰減正弦波的調(diào)制函數(shù)，該調(diào)制函數(shù)與物體的頻率信號疊加后，就是最終的物象信息。

當(dāng)然，作為一種探測儀器，儀器的狀態(tài)當(dāng)然非常重要，但更重要的是能夠制備出厚度較為適宜且品性良好的生物大分子電鏡材料樣品。

（二）生物大分子電鏡樣品的制備方法

為了保證電子顯微鏡中電子光路的穩(wěn)定性并消除由空氣引起的電子散射，電子顯微鏡內(nèi)部都是高真空環(huán)境。理想情況下，生物大分子需要存在于完全適應(yīng)本體真實生活環(huán)境的溶液中。這就產(chǎn)生了一個矛盾：電子顯微鏡的高真空與生物樣品的自然生存環(huán)境之間的矛盾。為了解決這一問題，必須開發(fā)特殊的生物樣品制備方法和合適的樣品載體以及相應(yīng)的電子顯微鏡裝置。下面簡要介紹兩種當(dāng)前最主要的生物大分子電鏡樣品的制備方法：冷凍電鏡法和負(fù)染色法。

1）冷凍電鏡技術(shù)（cryo-electronmicroscopy）

冷凍電子顯微鏡，簡稱冷凍電鏡，是指將生物大分子快速冷凍后，在低溫下用透射電子顯微鏡對樣品進(jìn)行成像，并通過圖像處理和重構(gòu)計算得到樣品的三維結(jié)構(gòu)。單顆粒低溫電子顯微鏡技術(shù)可以觀察到少量的非晶態(tài)生物樣品，獲得高分辨率的圖像，因此，冷凍電鏡技術(shù)已成為研究生物大分子結(jié)構(gòu)的重要手段。

冷凍電鏡樣品制備的基本流程是將載有樣品的電子顯微鏡網(wǎng)格快速投入冷卻的液態(tài)乙烷中，在載網(wǎng)孔或支持膜中形成玻璃態(tài)的冰，樣品顆粒（ 粒徑大約十幾到過百納米）分布在其中，形成冷凍樣品。玻璃體生物樣品可進(jìn)一步制備成超薄切片，在冷凍電鏡下可觀察到近乎活體的超微結(jié)構(gòu)。高壓冷凍樣品制備技術(shù)避免了樣品中可溶性成分的提取、丟失和移位，使研究人員能夠直接觀察到接近生存狀態(tài)的細(xì)胞和組織的自然形態(tài)。

電子束輻照引起的損傷取決于電子劑量、樣品的溫度和電子束的能量。生物樣品的性質(zhì)決定了必須采用低劑量電子成像技術(shù)。對超低溫樣品的觀察，不僅解決了樣品中水分含量的問題，而且減少了電子輻照和溫度提升對生物樣品的損傷。然而，這種低劑量成像的最大問題是單張電子顯微鏡圖像的信噪比較低，照片襯度低，由此導(dǎo)致圖像模糊。因此，新的成像設(shè)備和強(qiáng)大的圖像處理系統(tǒng)對冷凍電鏡的發(fā)展至關(guān)重要。2012-2013年，電子直接檢測相機(jī)（ electrondirect detection device，DDD）的應(yīng)用使冷凍電鏡突破了技術(shù)難關(guān)。DDD相機(jī)能直接探測高能電子，使信噪比和空間分辨率大大提升。

2）負(fù)染色電鏡技術(shù)（NS EM）

負(fù)染色法最早由Brenner和Horne在1959提出。作為一種傳統(tǒng)的制備電鏡樣品的方法，負(fù)染色技術(shù)因其簡單、快捷、成像襯度高等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。這種方法主要用染色劑中的重金屬粒子沉積在大分子周圍，使大分子被包埋起來，這相當(dāng)于重金屬層形成一個中空的大分子輪廓（由于重金屬的分子量較大，大分子物質(zhì)將近似為空白物），由于重金屬粒子的滲入效應(yīng)，有時甚至可以顯示出大分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

一般生物樣品負(fù)染操作的流程是：將濃度符合要求的樣品溶液滴在經(jīng)輝光放電處理后的載物片上，并保持一段時間（約1分鐘）；然后將多余的溶液除去，然后迅速滴上染色劑，并使染色劑與生物樣品顆粒充分接觸（反應(yīng)數(shù)十秒至數(shù)分鐘），把多余的染色劑吸除后干燥即可。

現(xiàn)如今，雖然冷凍電鏡被廣泛使用，負(fù)染色技術(shù)仍然被廣泛應(yīng)用于高分辨率電子顯微鏡的結(jié)構(gòu)研究中。事實上，冷凍三維結(jié)構(gòu)研究的最初階段大多要先經(jīng)過負(fù)染電鏡研究，有時研究時長長達(dá)數(shù)年。

（三）基于透射電鏡的生物大分子三維結(jié)構(gòu)重構(gòu)

僅憑借生物大分子的氨基酸序列并不能夠完全揭示大分子的功能原因。事實上，正是這些氨基酸序列的三維結(jié)構(gòu)決定了生物大分子的功能狀態(tài)。因此，如果要研究生物大分子的功能，就必須了解它的結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，隨著計算生物學(xué)的迅速發(fā)展，X射線晶體學(xué)、核磁共振（NMR）和電鏡技術(shù)已成為當(dāng)今生物結(jié)構(gòu)檢測的主要手段。

然而，X射線晶體學(xué)需要多維結(jié)晶的樣品，核磁共振則需要樣品有序，且對樣品分子量有一定限制。電鏡方法則可以不需結(jié)晶，并對分子量沒有限制，而且還可以采用瞬時冷凍的方法保持生物大分子的天然活性，甚至可以單獨(dú)觀察并重構(gòu)任意一個大分子的三維結(jié)構(gòu)，從而顯示出其獨(dú)特的優(yōu)勢。

參考文獻(xiàn)：

胰蛋白結(jié)構(gòu)與功能的透射電子顯微鏡研究 張磊

冷凍電鏡技術(shù)：從原子尺度看生命 楊慧，李慎濤，薛冰

冷凍電鏡單顆粒技術(shù)解析生物大分子結(jié)構(gòu)綜述 張世超，歐陽燕，劉善輝，朱莉